CUBIC 组织透明化试剂
具有单细胞分辨率的全脑/全身成像
CUBIC Trial Kit是一款用于透明化技术CUBIC(Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)的试剂盒。 该方法由上田泰己教授和洲崎悦生教授等人开发。 只需将组织浸入试剂盒包含的溶液中,即可对小鼠大脑和全组织、灵长类的全脑和甲壳类的全组织进行透明化处理和折射率调整。 该方法有望应用于病理学研究和单细胞水平中的观察。 点击此处查看百篇引用和使用CUBIC的文献! | 数据提供:国立研究开发法人理化学研究所上田泰己教授、洲崎悦生教授 |
◆CUBIC特点
● 操作简单(只需浸入溶液)
● 可透明化整个器官
● 小鼠全脑透明化只需两周
可进行透明化的组织
小鼠大脑和全组织,灵长类全脑,鱼类、甲壳类、甲虫等的全组织,骨骼(需进行脱钙处理)
CUBIC Trial Kit试剂盒组成
1. ScaleCUBIC-1 Solution——250 mL x 1支
2. ScaleCUBIC-2 Solution——250 mL x 1支
3. Mounting Solution-1——40 mL x 1支
4. Mounting Solution-2——40 mL x 1支
透明化处理需准备
▼ 试剂:
▼ 1. CUBIC Trial Kit
▼ 2. 多聚甲醛(产品编号:160-16061)
▼ 3. PBS×1(产品编号:164-25511)
▼ 实验用具:
▼ 1. 5 mL/15 mL/30 mL/50 mL锥形管(配合样品使用)
▼ 2. 摇床
▼ 3. 用于观察CUBIC透明化样品的荧光显微镜※和推荐物镜※※
※共聚焦显微镜、双光子显微镜、光片显微镜
※※与折射率 (RI=1.49)相匹配的物镜。
※※建议在使用之前咨询显微镜制造商。
◆CUBIC实验方案事例
● 组织透明化实验方案示例(完整器官)
● 组织透明化实验方案示例(2 mm 切片)
● 荧光蛋白表达组织适应实验方案示例
● 免疫组织染色实验方案示例
▍ 透明化实验方案示例(完整器官)
请注意,组织透明化实验方案中所用试剂用量、处理时间需根据样品尺寸进行调整。此外,建议在灌注固定后,取出并重新固定样品。
各个步骤中使用的试剂量约为12-15 mL,清洗时建议使用试剂量的5-10倍。
*每2天更换新溶液
**建议以2 : 8、3:7的比例混合 (RI = ~1.49) 试剂盒中的Mouting Solution 1 和 2 使用
图1.使用Scale CUBIC Solution透明化前后小鼠所有器官的案例
▍ 组织透明化实验方案示例(2 mm 切片)
各步骤中使用的试剂量约为2.5 mL,清洗时建议使用试剂量的5-10倍。
**建议以2 : 8、3:7的比例混合 (RI = ~1.49) 试剂盒中的Mouting Solution 1 和 2 使用。
图2.使用CUBIC透明化小鼠组织切片的案例
▍ 荧光蛋白表达组织适应实验方案示例
*每2天更换新溶液
**建议以2 : 8、3:7的比例混合 (RI = ~1.49) 试剂盒中的Mouting Solution 1 和 2 使用
***下图数据使用【PI 5 µg/mL in PBS(NaCl 1.5 M),0.05 % NaN3】
图3. CUBIC处理(PI染色)后CAG-EGFP Tg小鼠完整器官的LSFM成像
▍ 免疫组织染色实验方案示例
脑组织块的免疫染色案例,详细实验方案请见参考文献(1)
*每2天更换新溶液
**分别用以下溶液稀释抗体
一抗:0.1% (v/v) Triton X-100, 0.5% (w/v) bovine serum albumin, 0.01% (w/v) sodium azide in PBS
二抗:0.1% (v/v) Triton X-100, 0.1% (w/v) bovine serum albumin, 0.01% (w/v) sodium azide in PBS
***建议以2 : 8、3:7的比例混合 (RI = ~1.49) 试剂盒中的Mouting Solution 1 和 2 使用。
使用抗体 【一抗】 Goat anti-Copeptin (1: 100) Rabbit anti-VIP (1: 300) 【二抗】 Donkey anti-goat Alexa 546 (1: 750) Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1: 750) |
图4.使用CUBIC处理的脑组织块经三维免疫染色后单光子显微镜成像
◆CUBIC应用案例
● 结合病理学方法的应用案例
● 鱼类透明化案例
● 甲壳类(螃蟹、鼠妇)透明化案例
● 甲虫(金龟子、独角仙、锹形虫)透明化案例
● 小鼠全脑血管网络可视化案例
▍ 结合病理学方法的应用案例
数据来源于S. Nojima.et al. : Scientific Reports ,7,9269 (2017)/已收录
图5.使用CUBIC处理各种人器官的切片案例
-经CUBIC处理后可以进行石蜡包埋、切片和HE染色-
图6.用共聚焦显微镜观察 CUBIC 处理的人病理组织样品
▍ 鱼类透明化案例
数据提供:东京海洋大学 海洋生物资源学院 二见邦彦老师
图7.使用CUBIC的鱼类透明化案例
实验步骤参见参考文献5)
图8.使用CUBIC处理后的鱼类内脏切片案例
-CUBIC处理后,切片5 μm,可用Mayer’s Hematoxylin染色-
图9.用抗体观察CUBIC处理后斑马鱼鳃的内脏片
▍ 甲壳类(螃蟹·鼠妇)透明化案例
数据提供:浜松医科大学 医学分光应用寄附研究生 绀野在老师,冈崎茂俊老师
图10.使用CUBIC的甲壳类透明化案例(上:螃蟹,下:鼠妇)
实验步骤参见参考文献6)
图11.观察CUBIC处理后(PI染色)的完整甲壳类(左:螃蟹,右:鼠妇)
实验步骤参见参考文献6)
▍ 甲虫(金龟子、独角仙、锹形虫)透明化案例
数据提供:东京大学大学院 理学系研究科生物科学专业 黑田真也老师
甲虫透明化需经过固定、漂白和透明化处理。
详细实验步骤请点击此处查看。
图12.CUBIC处理后(PI染色)的甲虫透明化案例(左:金龟子,中:独角仙,右:锹形虫)
图片来源于参考文献7)
▍ 小鼠全脑血管网络可视化案例
数据提供:Miyawaki, T. et al. : Nat Commun., 27, 11(2020).
图 13. 使用胆盐(SDC)透明化小鼠大脑
(上)使用SDS进行去脂透明化,观察到组织肿胀。
(下)使用SDC进行去脂透明化,组织肿胀得到抑制,脑白质也被透明化处理。
实验步骤详见参考文献8)
图 14. 血管铸型后透明化小鼠大脑皮层
(左)使用SDS进行去脂透明化,在箭头部分观察到血管破裂。
(右)使用SDC进行去脂透明化,几乎未观察到血管破裂。
实验步骤详见参考文献8)
点击此处查看相关产品:组织透明化配套耗材:成像用透明室
组织透明化试剂Q&A ver1.0
Tissue clearing reagent Q&A ver1.0
Q:组织透明化的原则
A:组织透明化通常是按下面的步骤进行的:
A(a)固定 (b)透化 (c)脱色 (d)折射率匹配
Q:组织透明化的优势
A:目前大多数可用的透明化技术,都是通过编码荧光报告蛋白或者用荧光标记抗体进行后标记,从而可视化组织中特定的蛋白。组织透明化成为
A:了具有单细胞分辨率的组织3D成像中重要的一环。
Q:透明化技术的比较
A:下面是水性的透明化技术。
A:SeeDB(基于果糖的方法)在一些应用中有一定优势。因为SeeDB不含去垢剂,所以对于透明化 DiI(细胞膜红色荧光探针,一种神经示踪剂)标记的样品和使用光电关联显微镜(CLEM)的情况下,SeeDB 有着一定优势。另外 SeeDB 会产生自体荧光,有时候会对辨认未标记的神经元结构(如神经毡)起着一定帮助。
A:SeeDB2 是为使用高 NA 物镜的高分辨率成像而优化的技术;因此,当处理较大的组织时,CLARITY 或者 CUBIC 会是更好的选择。
Q:切片厚度的最大值和最小值?
A:您应该根据您的物镜的 WD(工作距离)来决定切片的厚度。我们建议切片的厚度不要超过 3 mm。对于十分薄且脆弱的样品,我们建议使用
琼脂糖包埋。使用 CUBIC,可以让全器官、全身透明化和使用 LSFM 的快速 3D 成像具有可重复性。
Q:试剂盒成分
A:具体如下:
A:1. SCALEVIEW-S试剂盒(299-79001)适用于20份1-2 mm的切片样品
A:A:1) SCALEVIEW-S0——100 mL
A:A:2) SCALEVIEW-S1——100 mL
A:A:3) SCALEVIEW-S2——100 mL
A:A:4) SCALEVIEW-S3——100 mL
A:A:5) SCALEVIEW-S4——100 mL
A:A:6) SCALEVIEW-SMT——100 mL
A:2. SCALEVIEW-S试剂盒(290-80801)适用于20-30份1-2 mm的切片样品。
A:A:1) SCaleCUBIC-1 Solution——250 mL
A:A:2) SCaleCUBIC-2 Solution——250 mL
A:A:3) Mounting Solution 1——40 mL
A:A:4) Mounting Solution 2——40 mL
A:3. SeeDB试剂盒(299-79901)适用于20-30份1-2 mm的切片样品。
A:A:1) SeeDB:20w/v% Fructose Solution——50 mL
A:A:2) SeeDB:40w/v% Fructose Solution——50 mL
A:A:3) SeeDB:60w/v% Fructose Solution——50 mL
A:A:4) SeeDB:80w/v% Fructose Solution——50 mL
A:A:5) SeeDB:100w/v% Fructose Solution——50 mL
A:A:6) SeeDB——50 mL
A:4. SeeDB2试剂盒(294-80701)适用于20-30份1-2 mm的切片样品。
A:A:1) Saponin(皂角苷)——5 g
A:A:2) SeeDB2G solution——50 mL
A:A:3) SeeDB2S solution——50 mL
A:A:4) PBS——50 mL
Q:样品的保存
A:SCALEVIEW-S处理的样品应在室温下保存2至3周。您可以在2至3周内观察SCALEVIEW-S透明化的样品中的荧光信号。
A:CUBIC处理的样品应在室温下保存1周。您可以在1周内观察CUBIC透明化的样品中的荧光信号。
A:SeeDB2G处理的样品应在冰箱中保存1年,而SeeDB2S处理的样品则可在室温下保存1年。您可以在1年内观察SeeDB透明化的样品中的
荧光信号。
Q:抗体的荧光标记
A:应在进行透明化前就进行抗体的荧光标记。
Q:适用于SCALEVIEW-S的显微镜
A:SD-OSR(Olympus)
A:FV-OSR(Olympus)
Q:适用于CUBIC的显微镜
A:SD-OSR(Olympus)
A:FV-OSR(Olympus)
A:Zeiss Lightsheet Z.1(Carl Zeiss)
Q:适用于SeeDB2的显微镜
A:Confocal(最好使用高NA的油浸镜头)
A:STED(Leica Microsystems)
A:SR-SIM(Carl Zeiss)
A:SD-OSR(Olympus)
A:FV-OSR(Olympus)
A:Airyscan(Carl Zeiss)
A:HyVolution(Leica Microsystems)
A:Two-photon(最好使用复合浸没镜头)
A:Confocal(最好使用高NA的甘油浸镜头)
A:Light-sheet DLS(Leica,最好使用定制镜面的设备)
Q:重构
A:对于定量用途,我们建议使用Neurolucida系统(MBF)。我们同样测试了VAST Lite用于成像用途时的表现。重构时也可以使用开源软件。
例如,Vaa3d可以处理大量的拼接图像的数据。
Q:物镜推荐
Q:其他物种?其他器官?
A:对于昆虫样品和鱼类样品,建议选择CUBIC。
A:昆虫相关文献:Ohuma.et al.: Fish Pathology, 52(2), 96(2017).
A:鱼类相关文献:Konno and S.Okazaki .: Zoological Letters, 4:13(2018).
对于多细胞球状体,选择SCALEVIEW-S会更好。
https://www.nature.com/articles/s41598-018-29169-0
参考文献
[1] E. A. Susaki. et al. : Cell ,157(3),726(2014).
[2] K. Tainaka. et al. : Cell ,159(4),911(2014).
[3] E. A. Susaki. et al. : Nature Protocols ,10,1709(2015).
[4] S. Nojima. et al. : Scientific Reports ,7,9269 (2017).
[5] S. Ohnuma. et al.: Fish Pathology, 52(2), 96(2017).
[6] A. Konno and S. Okazaki.: Zoological Letters, 4:13(2018).
[7] M Kuroda and S Kuroda (2020). Whole-body clearing of beetles by successive treatment of hydrogen peroxide and CUBIC reagents.
[8] Miyawaki, T. et al. : Nat Commun., 27, 11(2020).
◆CUBIC (clear, unobstructed brain / body imaging cocktails and computational analysis)引用和使用文献
产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 | 备注 |
290-80801 | CUBIC Trial Kit CUBIC试剂盒小包装 |
1 Kit | 组织透明化试剂 | - |
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