◆要点⑧：ELISA的反应温度和湿度

　　根据试剂盒指定的反应温度，需要维持实验室环境，从而保证实验室温度控制在指定范围内，因此温度管理对实验是十分重要的。进入夏天后室外气温超过30摄氏度的天数逐渐加多。我们很难对经常进出或开放式的房间进行温度管理。反应温度过高很容易引起空白对照或高浓度的标准品溶液的吸光度上升。如果显色反应进行过度就不能准确测量浓度较高的溶液。因此需要十分注意对温度的管理。

　　入冬后气温逐渐下降，必须引起注意的是湿度。除了注意室温化时间和反应温度，湿度也十分重要。冬天室外的湿度下降，而在开着暖气的房间里湿度还会进一步下降。反应时避免湿度低于30%（一般标准），且有空气对流的场所进行。静置反应时分注溶液的挥发部分会引起非特异性吸附，是空白对照值升高的原因之一。如果必须在这种环境中进行测量时，可以在溶液静置反应时用封板膜封好孔板。如果不能封闭孔板（仪器测量时），可以视情况盖上孔板盖。此方法虽然不如用封板膜封板效果好，但也会起到一定的防护作用。

◆要点⑨：ELISA的各个步骤中产生误差（偏差）的原因

●　96孔板的原因

      温度不均。

●　试剂的原因

      1.试剂浓度不均匀（冻结后溶解引起的溶质分布不均）。

      2.试剂稀释不均匀（搅拌不均匀导致溶液浓度的偏差）。

●　添加试剂、标准品与结合反应的原因

      1.试剂（标准品）的移液出现问题（移液枪的选择，使用者的操作手法）。

      2.温度的偏差（边缘现象），反应时间的偏差（测量者的操作技巧）。

●　添加试剂（1次反应）后第一次进行清洗时的原因

      1.清洗液溢出影响到旁边的孔。

      2.清洗液残留。

●　添加酶标记抗体（生物素标记抗体）和溶液反应的原因

      1.温度和反应时间出现偏差。

      2.标记抗体有非特异性吸附。空白对照值过高。

●　添加显色溶液及溶液反应的原因

      温度和反应时间出现偏差。

●　测量吸光度时的原因

      1.孔板中各个孔之间吸光度有偏差（孔底部的伤痕，底壁的厚度等原因）。

      2.吸光度测量的精确度（复孔测定时偏差大）有问题。确认光度计的校准情况。

【系统误差：关于偏差--测量值为什么会出现偏差】

●　关于标准品

      纯度低，重量测量的偏差（例如吸收了水分），稀释的偏差，吸附现象，结构上的差异（重组）等。

●　关于测量试剂

      采样方法（溶血，乳糜），保存方法（变性），存在分解酶，结合蛋白，测量对象的结构多样性，添加了阻碍测量酶活性的物质，使用不同的移液枪添加标准品溶液等。

●　关于抗体

      抗体不能等效识别标准品和待测样品中的目标物质。特异性不充分导致样品中非特异性物质的混入测定。

●　关于测量曲线和测定方法

      1.生成的标准曲线和试剂反应产生偏离。例如，生成标准曲线的检测孔位于孔板的边缘会引起边缘效应、不同试剂成分对抗原抗体反应速度、反应平衡造成影响。

      2.吸光度测量装置有偏差（例如光检测器有偏差）。

      3.显色时间衰减。

      4.标准曲线的回归方程式不合适（准确性有偏差）。

◆要点⑩：操作技巧的比较

　　ELISA技术看上去好像很简单，也是ELISA的“卖点”，但其实也是对操作熟练度有所要求的一种技术。利用分析法验证实验室间重复精度的研究，一方面也可应用在测量室或操作者的技能判定（proficiencytest、PT）上。首先定期从相同的材料中选出试剂分配给操作人员，再向计划实施管理人员报告分析的结果，最后将该结果和全部的数据一起反馈给各个操作者。操作人员通过反馈结果纠正自己的技术，并在下次分析中确认纠正情况。Z score是操作技能判定的标准之一。

z =（ x － xa）／σ

x：一名操作者得到的测量值

xa：多名熟练操作者测量的平均值

σ：实验结果的标准偏差的目标值

判定标准：Z score的绝对值，｜z｜＜2时得出的结果合适，2 ＜｜z｜＜3时可信度较低，｜z｜＞3时结果不被接受。

◆ELISA疑难解答

D：空白对照（Blank）的吸光度高

原因和解决方法

１．孔板干燥的可能性

　　清除各个孔的清洗液后，下一次加液时间间隔过长，又或者将各个孔直接对着空调出风口，都有可能使孔板变得过于干燥。

2．高浓度浓缩液的稀释错误

　　确认稀释率是否按照指定稀释倍率进行稀释。

3．清洗不彻底

　　1.使用自动洗板机时，需要设定符合试剂盒的清洗模式，确认无误后方可使用。对于洗板机吸取、排放喷管的位置，各列的吸取量，清洗液喷射的压力及吸取后的残留量等进行必要的检查。

　　2.手动清洗时清洗效果不好，可通过适当增加清洗次数来解决这个问题。特别是在酶结合物的反应后一定要进行彻底清洗。在孔板的孔中倒满清洗液，再将孔板放在手掌上轻摇10秒后倒掉清洗液可提高清洗效果。

４．反应过度

　　要在合适的温度及规定的时间内进行孔板的孵育。

　　E：复孔测定时各孔间的偏差较大

原因和解决方法

　　偏差也就是测量精度变大的主要原因是，反应不均匀的进行和移液的误差，以及检测样品的不均一性。

●　反应不均匀进行的各种原因

１．吸取清洗液时，使用的吸液器触碰了孔板底部。

２．加液时移液枪的顶端刮到孔的底部。用8排、12排移液枪加液时枪头很难与孔板平行，所以很可能会刮到孔的底部。

３．孔板的反应温度不同会导致反应过程出现偏差（边缘现象）。

４．孔板对着空调的冷风（夏天）和机器的冷却设备的出风口的暖风，会使温度产生偏差。另外，如果孔板的旁边有烘箱或发热设备，辐射热会引起边缘现象。

５．空调或电脑的暖风吹到孔板，会使孔板变得干燥。

６．清洗液清除不彻底，残留在孔板中。

●　移液的偏差，特别是往孔中添加标准溶液或样品时，移液的偏差会直接导致测量值的偏差。

●　移液枪的堵塞

　   冰冻保存的血浆解冻时会析出纤维蛋白。直接用移液枪取样，纤维蛋白可能会堵塞枪头，导致无法准确吸液。

●　样品不均一

      检测样品通常会冰冻保存，大多情况下会在检测时解冻，血清或血浆样品，在冻存和溶解时，会发生蛋白部分先融后冻，这样很容易会引起保存容器底部的蛋白溶液浓度高于上部。这样取样的话第一次和第二次的取样浓度就会有差异，各孔间的偏差就会变大。所以冻存后的蛋白溶液必须混匀后再取样。

●　使用8排、12排的移液枪要先确认各个枪头吸取、排出的液量相等后再使用。

      F：按照使用说明书绘制出标准曲线，但无法读取样品的测量值，或读取的测量值异常。

原因和解决方法

●　全部检测样本的吸光度偏低

      检测物质失活

      添加分解酶阻碍剂防止失活

      检查保存条件

      检测样品中有酶阻碍剂（N^3-，F^-）

      停止使用酶阻碍剂

      添加检测样品后要充分清洗

      存在阻碍反应的物质

      增加回收试验

      尝试进行稀释直线试验

冻存样品的影响

　　将极少量的血清或血浆放入比较大的容器中冻存，水分蒸发后血清或血浆浓缩，蛋白浓度上升，可能会阻碍反应进行，并使测量物质变性。检测时特别注意量小的小鼠的样品。测量前尽量使用小的储液管充分混匀。

●　从组织或细胞中提取的样品、亲和层析或等电点分离的成分

      无法得到样品的测量值。

      样品的pH值超过了ELISA测定范围。

      先用缓冲溶液进行稀释，使溶液中性化后再测量

      用少量的酸、碱中和后再进行测量

      提取液中混入了有机溶剂

      有机溶剂会阻碍抗原抗体反应，所以要先用缓冲液稀释。注意pH值。尝试用缓冲液稀释，

      如果检测顺利进行就证明该方法可行。

●　检测样品的测量值过高（过低）

      比其他论文中的测量值高（低）

      该论文中试剂盒和该试剂盒的标准品的纯度不同

●　比平时的测定值高

      本次的使用试剂盒的标准品变性

●　比平时的测定值低

      检测样品在保存时失活（事故）

　　有关检测样品测量值的判断，管理血清（positive control）（保存的取自相同样品的小份血清）作为添加样品进行测定，确认是否能得与待测样品相同的测量值。

　　本报道根据若林克己著的《ELISA A to Z》(Shibayagi株式会社发行)，由Shibayagi株式会社编辑而成。

~关于ELISA A to Z~

　　最初，我在射线医学综合研究所引进了作为微量测量法的Radioimmunoassay （RIA），之后在群马大学也继续对研究人员进行启蒙教学。RIA只要有极少量的抗体和抗原就能简单构成，可以说是穷人测量法，但使用RIA在理论上是有测量灵敏度限制的。后来我加入了Shibayagi株式会社，开始尝试对ELISA进行改变，了解ELISA的优点，努力提高这项技术。作为总结，我写出了这篇《ELISA A to Z》。这是为了让初学者能理解ELISA的使用方法和注意点而写的文章。 

若林克己