氨基酸分析的历史及茚三酮柱后衍生氨基酸分析法



株式会社日立テクサイエンス(日立高科技股份有限公司) 伊藤 正人


 "氨基酸分析〜新趋势〜"系列之一

(味の素株式会社)味之素股份有限公司 创新研究所  宫野 博 

 

  氨基酸是蛋白质的组成成分,也是重要的代谢物。氨基酸检测技术始于1941年的分配色谱,现在仍在持续发展——高灵敏度化、快速化、D-氨基酸检测方法的开发及准确定量分析需要的环境维护等。氨基酸分析技术的进步应用于生物化学和营养学等研究领域,对丰富人们的生活做出贡献。

  本连载由实际开发各种技术的老师执笔,为读者们提供氨基酸分析的新信息。



◆前言


  人们认为氨基酸是生命起源最初形成的复杂物质。不过神奇的是构成我们身体的蛋白质仅由L-氨基酸组成。L-氨基酸是光学异构体之一。L-氨基酸是一种光学异构体,在生命诞生的初期,地球内外每个角落的L-氨基酸比D-氨基酸自发地占据主导地位,由此可见,L-氨基酸的增殖是必然的。为了解开谜团,探索来自地球外的生命构成物质。虽然它是掌管生命的基本氨基酸,但蛋白质的组成氨基酸有20种,由于它们的分子结构相似,为了分析它们,首先必须分离每种成分。而且,由于大多数氨基酸分子对紫外线的吸收不具有特异性,因此通常使用的色谱检测法——紫外吸收光谱法并不能直接使用。实际上,在下文中设计了由几种分离方法和衍生化检测法组合而成的分析方法。

 


氨基酸分析法


  在第17次修订的日本药典中收录了8种氨基酸分析方法作为参考1),但如上所述,无论哪一种方法都不是直接检测氨基酸分子,而是检测氨基酸衍生物(表 1)。氨基酸是具有氨基和羧基的两性离子(双性离子)物质,在水溶液中发生电离。由于在离子的状态下难以使用用于分离分析的反相色谱(反相HPLC)法,因此设计了一些在过柱前衍生化的柱前衍生法。利用离子交换色谱的话可以分离离子本身,但为了检测,有必要在分离后将其衍生化,这称为柱后衍生法。

  由表1可见,衍生法有优点也有缺点。在柱后衍生法中,虽然氨基酸的各成分通过离子交换色谱分离后与反应试剂混合发生衍生化反应,产生稀释和峰值扩散,但无论是生成多种反应物,还是处于反应过程中,影响都不大。因此,它可以准确定量,重复性好。柱前衍生法具有一个特征,即如果产物稳定且只有一种,则可以使用反相HPLC简单地实现高速和高灵敏度2)。另外,虽然反应试剂的消耗量相对较小,但反应效率可能会受样本基质影响。空白试剂无法用预装柱法检测,需要对空白试剂进行分离。在柱后衍生法中,必须选择对检测结果影响很小的试剂。柱后衍生法包括茚三酮法和OPA法,前者稳定性高,后者灵敏度高。

  据说反相色谱法比离子交换色谱法更高速更高效率,并且日本药典中还记载了应用此分离方法的六种预装柱法。每个方法都有其特点,首先PITC法是伴随Edman分解的衍生法,也被称为预柱法的起源。AQC法是通过荧光检测实现高灵敏度检测,但半胱氨酸(Cys)的检测限高于其他的成分。OPA柱前法是一种高灵敏度的荧光检测法,与方法7或8结合使用可以弥补不能检测到脯氨酸(Pro)等的仲胺的缺陷。DABS-Cl法应用了可见光分光光度法,比PITC法更具高选择性和高灵敏性。FMOC-Cl法能够对仲胺氨基酸进行高灵敏度分析,但组氨酸(His)的衍生物易分解,难以稳定检测,因此在某些情况下可与OPA预柱法结合使用。最后,NBD-F法能够分析包括仲胺等氨基酸,因此被称为实用的高灵敏度方法。

  虽然都是氨基酸,但是对于Pro,Cys,His等分析法都有各自的适用性,需要根据用途来使用。在本文中,我们重点回顾氨基酸分析的历史,讨论长期以来作为标准方法的茚三酮柱后检测法。

 


表1.  日本药典中记载的氨基酸分析法


方法

氨基酸分析法

分离方法

检出波长

检出限

直线性/范围

方法1

茚三酮柱后检测法

离子交换色谱

吸光 1:570  nm
吸光 2:440  nm

约10 pmol
    Pro约50 pmol

20~500 pmol

方法2

OPA柱后荧光检测法

离子交换色谱

激发348 nm
荧光450 nm

数十pmol
Pro可以通过特殊处理来检测

数pmol ~
数10 nmol

方法3

PITC柱前衍生法

反相HPLC

吸光 245 nm

几乎1 pmol

20~500  pmol

方法4

AQC柱前衍生法

反相HPLC

激发 250 nm
荧光395 nm

根据成分约40~320   fmol
Cys约800 fmol

2.5~200 μmol/L

方法5

OPA柱前衍生法

反相HPLC

激发 348 nm
荧光 450 nm

50 fmol、实际是1 pmol
没有检测出Pro

_

方法6

DABS-Cl柱前衍生法

反相HPLC

吸光 436 nm

约1 pmol

2~5 pmol是定量范围

方法7

FMOC-Cl柱前衍生法

反相HPLC

激发 260 nm
荧光 313 nm

数fmol
His衍生物分解

0.1~50 μmol/L

方法8

NBD-F柱前衍生法

反相HPLC

激发 480 nm
荧光 530 nm

约10 fmol

 


茚三酮法的历史


  历史追溯到3)1948年,Moore和Stein报道了用于氨基酸分析的茚三酮分光光度法。使用淀粉作为固定相的色谱法,探讨反应产物的吸收光谱与每种氨基酸成分的茚三酮反应特性的关系。1958年,Spackman与两位博士一同开发了一款应用氨基酸的色谱法自动记录色谱的装置4)。这正是表1中茚三酮柱后检测法的前身。1962年,日立研发了同类型的KLA-2型氨基酸分析仪5)(图1)。作为一款早期日本制造的KLA-2,分析仪搭载着两个内径9 mm,长度分别为50 cm和150 cm的玻璃柱。当时,填充离子交换树脂呈破碎状,粒径约为300~1,000 μm。用短柱分析赖氨酸(Lys)~精氨酸(Arg)等碱性氨基酸,需耗费4个小时,用长柱分析天冬氨酸(Asp)到苯丙氨酸(Phe)等酸性或中性氨基酸需耗费15个小时。如果算上样本添加等时间,这种分析方法大约是一天检测一个样本。

  1977年4月,一则新闻报道称,有日本渔船在新西兰海岸附近捕获到了神秘动物,可能是发现了怪兽,像尼斯湖的尼斯湖水怪一样的蛇颈龙6)。随后将神秘动物黏着在甲板上的胡须状的前鰭带到日立制作所那珂工厂,并用当时先进的机器尝试对前鳍进行氨基酸成分分析。由于它检测出胶原蛋白特有的组成成分,查明它是鲨鱼的鳍棘,怪兽的梦在发现神秘动物的第三个月化成泡影。从使用835型起,便开始了在10 MPa以上的高压下进行分析的高效液相色谱(HPLC)氨基酸分析仪的时代(图2)。填充料采用粒径5 μm的球形树脂。使用内径为4 mm,长度为150 mm的不锈钢柱,使用同一根柱子检测酸性、中性和碱性的氨基酸。分析速度提升至约50分钟内分析18种蛋白质水解产物的氨基酸成分。


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   图1. KLA-2 型(1962)             图2. 835型(1977)            图3. LA8080 AminoSAAYA®(2017)

 


茚三酮法的现在


  2017年,小巧简易型的台式高速氨基酸分析仪LA8080公之于众7)(图3)。茚三酮法的检测原理与Moore等人的报告4)相同,如最新的流程图(图4)所示。在约20种成分的蛋白质水解产物的氨基酸分析中使用柠檬酸钠缓冲液,在约40种成分的生物液体由来的氨基酸分析中使用柠檬酸锂型缓冲液。洗脱液由泵1送出,通过用于除去氨的过滤柱,到达自动取样器。天冬酰胺(AspNH2)和谷氨酰胺(GluNH2)易于氧化,冷藏保存可有效抑制氧化。柱子用导入了磺酸基的强酸性离子交换树脂(粒径3 μm)填充,并且通过珀耳帖效应的柱式恒温装置控制柱子温度。为了柱后衍生化,对于从分离柱洗脱的各个氨基酸与来自泵2的茚三酮溶液混合。反应装置在盒状的TDE 3(立方体)反应堆中恒温保持在135°C。检测器在570 nm3)下检测氨基酸的蓝紫色反应生成物的吸光度。另一方面,仲胺Pro和羟脯氨酸(Hypro)与茚三酮溶液反应不生成蓝紫色产物,检出波长是440 nm。该检测波长与Moore等人的装置4)完全相同。



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图4.  茚三酮衍生法的流程图

 


  通常使用6 mol / L盐酸在110℃ 24小时的条件下进行蛋白质水解。在定量分析Cys或甲硫氨酸(Met)时,使用甲酸氧化后再用盐酸水解。另外当检测色氨酸(Trp)时,也有用碱水解的方法。图5为茚三酮法的应用——蛋白质水解物的色谱图(注入2 nmol的各标准品成分,柱温恒定在57℃)。异亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)具有相似的分子结构,难以用色谱分离,获得的分离度在1.2以上。此外,SN比2的Asp的检出限为2.5pmol以下,甘氨酸(Gly)和组氨酸(His)的峰值面积再现性RSD在1.0%以下。然而Cys在标准品中是以二硫键结合胱氨酸的状态存在。

  另一个应用是生物液体分析。顾名思义,就是分析动物的血清和尿液等样本,但在保健品、葡萄酒和酱油等食品中的牛磺酸(Tau),GABA (γ - ABA),鸟氨酸(Orn)一类包含约40种氨基酸成分的样品也可以进行分析。使用程序降温的生物液体分析方法(注入2 nmol的各标准品成分)获得了良好的色谱图(图6)。除了分离AspNH2和GluNH2之外,也可检测如二肽鹅肌肽(Ans)和肌肽(Car)。羟基赖氨酸(Hylys)具有构象异构体,当色谱柱良好时,可明显看见双峰。瓜氨酸(Cit)和α-氨基丁酸(α-ABA)或1-甲基组氨酸(1-Mehis)和3-甲基组氨酸(3-Mehis)也难以分离。

  最后,阐述一下Moore等人的茚三酮柱后衍生法被广泛使用的原因。原因之一在于分离方法。以氨基阳离子交换色谱为基础8),基本上,以每种氨基酸各成分的等电点顺序排列保留时间。这个方法存在一种仅依靠上述内容无法说明的分离机制。这种分离机制的模式是以苯乙烯为填充剂载体和二乙烯基的共聚物影响的疏水性相互作用模式。例如,它能有效分离苯丙氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸。开发人员可以通过调整洗脱液组成,逐步洗脱的切换时间和柱温等巧妙地操作离子交换和疏水性的相互作用来实现目标成分的分离。

  使用茚三酮柱后衍生法的另一个原因,氨基是关键点并且生成鲁赫曼紫。由于柱后法可以分离样本中的杂质,不易受到杂质干扰。因此,即使是食品或生物体来源的样本,通过脱蛋白和过滤进行可靠的预处理,可使数据具有高可靠性。由于生成的蓝紫色产物特异性很高,且检测可见光区域的吸光度发现色谱图中几乎不会出现干扰峰。因此,定量分析的再现性良好,并且检测的动态范围宽,从而可以确保4位以上的线性。另外,只要将茚三酮溶液保存在阴暗处,就难以变质且稳定。

 


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结语


  在许多氨基酸分析方法特别是茚三酮柱后衍生法中,探讨分离方法,虽然花费分析时间,但能确保一定的分离度,所以最终能获得高精度的定量分析,就是它的魅力所在。对于开头所提到的非对称性研究,期待在本连载中可以揭示从L-氨基酸中分离D-氨基酸的分析方法。

 


谢辞


  衷心感谢味之素创新研究所基础技术学院的宫野博所长和小泽真一研究员以及出口喜三郎 元北海道大学特任教授的对本文的指导。

 


〔参考文献〕

[1] 一般財団法人 医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス財団編:「第十七改正日本薬局方」(じほう)(2016).

[2] 中村  洋監修:「ちょっと詳しい液クロのコツ前処理編」(丸善)(2006).

[3] 小澤真一、宮野博、伊藤正人:S. I. NEWS, 58, 4968(2015).

[4] Spackman, D. H. et al. : Anal.Chem., 30, 1190(1958).

[5] 宇井信生、岩永貞昭、崎山文夫共編:「タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー」(化学同人)(1984).

[6] 伊藤正人:ぶんせき,2010,145(2010).

[7] 伊藤正人、成松郁子、裴敏怜、森崎敦己、鈴木裕志、福田真人、八木隆、大月繁夫、関一也、豊崎耕作:S. I. NEWS, 61, 5360(2018).

[8] 伊藤正人、成松郁子、裴敏怜、森崎敦己、鈴木裕志、福田真人、八木隆、大月繁夫、関一也、豊崎耕作:S. I. NEWS, 61, 5360(2018).




◆产品列表


产品编号

产品名称

规格

包装

299-70501

Ninhydrin Coloring Solution Kit for HITACHI
日立氨基酸分析仪配套茚三酮显色试剂盒

日立高速氨基酸分析仪用

2L用



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