外泌体和生命现象——第四回 外泌体糖链分析建议

庆应义塾大学 医学部医化学 松田 厚志

细胞分泌的细胞外囊泡中，粒径为100 nm左右的囊泡称为外泌体，外泌体内含有固有的蛋白以及microRNA等。另外，由于表面存在脂质和糖蛋白，外泌体成为继血液循环肿瘤细胞和血液循环DNA后的第三个被关注的液体活检标记物，并且现在世界各国也竞相开展以microRNA、蛋白组学分析为中心的研究。外泌体的最外层与细胞一样被糖链覆盖，在外泌体标记开发中糖链可作为合适的标靶。用于临床上的肿瘤标记物识别多种不同糖链结构，如果可以捕捉到疾病特异性外泌体上糖链的变化 ，则可以期待将外泌体应用于生物标记的开发。

大部分蛋白在经过糖基化等翻译修饰后都可作为功能蛋白发挥作用。糖链被称为继基因、蛋白质之后的第三生命链，并与细胞增殖、分化、细胞应答等多种生命现象相关。另外，癌症、免疫疾病、感染病、阿尔茨海默症等大多是与糖链相关的疾病，尤其是癌症，癌症的转移、侵袭、增殖等已阐明了糖链的重要性。在癌症的诊断、治疗法的开发中，对于糖链研究的期待值很高，阐明糖链的分子生物学意义已成为重要的课题之一。

与链状的核酸和氨基酸序列相比，糖链存在多样性的分支和不同的结合形式（α，β- 结合），糖链不能像核酸那样扩增，并且只限使用蛋白质样探针（抗体）进行解析，这使得糖链的分析更为困难。然而，最近以质谱，微阵列技术为中心的糖链分析技术发生了惊人的革新，迄今为止已经报道了许多新的糖链肿瘤标记以及开发方法的案例。糖链这种高门槛的研究，随着这些技术的革新，现在使得每个人都可以轻松地进行分析研究。至今为止，研究人员利用结构特异性识别糖链的结合蛋白，并固定了几十种凝集素的凝集素微阵列系统^1），进而促进了各类糖链生物标记物的开发^2,3）。本方法的优点是与质谱分析相比，其灵敏度与通量方面更为优越（图1）。作为本系统应用的一环，能够实施对多种生物样本进行解析的实验方案，现在，凝集素阵列（Lectin‐Array）分析的对象涉及多方面，如体液、组织、细胞等等。粒子状的外泌体与细胞相比粒径虽然很小，但其表面却存在无数的糖蛋白、糖脂糖链。因此，可以成为很好的凝集素阵列分析对象。凝集素阵列（Lectin‐Array）分析是通过几十种的凝集素结合方式来推断糖链结构，进而发现与比较对象有差异的糖链（凝集素）模式，这被称为糖链分析。我们采用的外泌体分析实验是将提纯的外泌体粒子上的蛋白标记荧光。因此，外泌体的回收及其颗粒形态的保持是十分重要的。另外，因为凝集素微阵列具有高灵敏度，即使回收量低也可以进行分析，但是如果混入其他糖蛋白的话就会造成干扰，无法进行正确的糖链分析。因此，对提取的外泌体的纯度是有要求的。为了能够得到高纯度并保持完整颗粒状态的外泌体，使用MagCapture^TM Exosome Isolation Kit PS （下文简称为MagCapture）进行了外泌体提取实验。该试剂盒在后述的血液中外泌体糖链分析时发挥了出色的作用。

图1. 凝集素微阵列系统和外泌体糖链分析的流程

首先，我们以培养细胞作为模型，从培养上清中分离、提取外泌体，接着尝试通过凝集素微阵列进行糖链分析比较。作为比较对象，从相同细胞株的沉淀中提取细胞膜蛋白，并对蛋白上的糖链进行分析比较（图2）。从3种类型的胰腺癌细胞株（Capan-1,-2, HPAF-II）中获得的凝集素阵列数据进行层次聚类分析后发现，这些数据不是反映细胞株之间的差别，而是出色地反映出了膜蛋白和外泌体之间凝集素的差异（图2A）。说明了即使是相同的细胞株，其细胞膜糖蛋白上糖链和分泌的外泌体上糖链的结构也是不同的。另外，即使都是外泌体，它详细的糖链图谱结果也是不同的（图2B），由此可以看出，将外泌体用作糖蛋白分析比较的标记是可行的。

图2. 胰腺癌细胞来源外泌体和细胞膜糖蛋白的糖链比较图

（A）通过层次聚类分析进行clustering

（B）各细胞株来源细胞膜蛋白，外泌体表层糖链的凝集素阵列结合形式

以培养上清液作为模型的外泌体分析已取得了一定程度的进展。进行血清来源外泌体的比较分析时，由于含有混杂的糖蛋白，因此要极为小心。换言之，在进行血液中外泌体糖链分析时，提取高纯度的外泌体是十分重要的。比较了超离法、聚合物沉淀法和MagCapture三种外泌体提取方法并进行糖链的分析。使用超离法和聚合物沉淀法时，健康者和癌症患者的糖链分析结果的差异不是很大。原因是用该类方法提取的外泌体组分用电泳分析后，可以看到过量的以球蛋白为首的血清糖蛋白的条带，这会干扰糖链的分析比较，而血清外泌体糖链分析中，使用可以提取高纯度外泌体的MagCapture可能是较为合适的试剂盒。最后根据MagCapture试剂盒提取外泌体的实验流程，作为凝集素阵列分析中必要使用的外泌体量，在换算后仅相当于数微升的血清样品量，因此，确认该方法可以用于血液中高灵敏度的外泌体糖链分析比较实验。并且本试剂盒提取的外泌体可以很好的保持完整颗粒状态。根据该实验流程，实际上可以在健康者和疾患群（A、B、C）混合血清中进行外泌体的比较糖链分析。分析主要成分的结果中显示，各患者血清外泌体表层的糖链分析结果都有所不同（图3），建议将外泌体糖链作为新的外泌体诊断指标。

图3. 血清外泌体的比较糖链分析图

（A）各混合血清中提取外泌体的银染和抗CD63抗体蛋白印迹

（B）使用了凝集素阵列分析数据的主要成分分析

现在正在尝试开发临床应用的糖链外泌体标记物。以基因组和蛋白组学分析为中心的外泌体的本质正逐渐被阐明。近年，随着不断创新的血液中外泌体检测方法的开发，对外泌体进行定量检测成为了可能，使其临床应用也更进了一步。如果可以发现疾病特异性外泌体糖链，就可以期待应用这样创新的外泌体定量系统，开发出实用的标记物。通过与其他组学分析的结合，发现特异性糖链的验证方法等还有很大的改良空间，但是我们已经迈出了外泌体糖链标记物开发的第一步。

◆参考文献

1）Kuno, A. et al. : Nat. Methods, 2, 851 （2005）.               

2）Matsuda, A. et al. : Hepatology, 52, 174 （2010）.

3）Matsuda, A. et al. : Anal. Chem., 87, 7274 （2015）.          

4）Yoshioka, Y. et al. : Nat. Commun., 5, 3591 （2014）.

5）Kabe, Y. et al. : Clin. Chem., 64, 1463 （2018）.

◆MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS