本文摘自和光纯药时报Vol.87 No.1（2019年1月号），由FUJIFILM株式会社环境与品质管理部安全性评估中心山本裕介教授、藤田正晴教授、笠原利彦教授以及勝岡尉浩教授共同执笔。
◆前言
从动物福利的观点出发，动物实验的规定正在世界范围内不断推进。从1993年开始，欧盟开始分阶段实施化妆品成分的动物实验规定，2013年之后，欧盟各国全面禁销含有进行过动物实验的原料的化妆品[1]。
在这样的背景下，不使用动物的安全性测试（动物试验替代法）的开发迫在眉睫，皮肤刺激性、眼睛刺激性、皮肤腐蚀性、皮肤致敏性、光毒性等的动物实验替代法作为获国际认可的方法，被列入经济合作与发展组织（OECD）的测试指南（TG）中。2006年，日本修订并实行动物爱护管理法[2]，此后，3R原则※在实验动物中得到了加强。
对此，日本也积极推动动物实验替代法的开发，替代眼睛刺激性测试的体外短时暴露试验[3]（STE，Short Time Exposure in vitro test method）（OECD TG491）、替代皮肤致敏测试的细胞系活化试验[4]（h-CLAT，human Cell Line Activation Test）（OECD TG442E ; ANNEX I）以及IL-8 Luc试验[5]（IL-8 Luc assay，Interleukin-8 Reporter Gene Assay）（OECD TG442D ; Appendix IA）都被列入了测试指南中。
另外，日本还开始研发替代法需要用到的材料，使用3D培养皮肤模型的用于替代皮肤刺激性测试的重组人表皮试
验[6]（Reconstructed Human Epidermis Test Method，OECD TG439）和使用3D培养角膜模型的用于替代眼睛刺激性测试的重组类似人角膜表皮试验[7]（RhCE，Reconstructed Human Cornea-like Epithelium Test Method）（OECD TG492），都采用了Japan Tissue Engineering Co., Ltd.生产的皮肤和角膜模型。
除上述化妆品行业外，欧盟的《化学品的注册、评估、授权及限制法规》——REACH法规在2016年6月也修订了REACH附录Ⅶ和Ⅷ，规定每年生产和进口不超过10吨的物质必须使用动物实验替代法来作为皮肤腐蚀性、皮肤刺激性、眼睛刺激性和皮肤致敏测试的标准测试法。
本文将为大家介绍新开发的试替代皮肤致敏测试的氨基酸衍生物反应法（ADRA，Amino acid Derivative Reactivity Assay）。
◆皮肤致敏的机制与替代法
皮肤致敏是一种由皮肤暴露在化学物质下引起的过敏反应。皮肤致敏性会使体内的免疫系统将化学物质记忆为异物，因此，当皮肤再次暴露在化学物质时就会表现出过度的反应，引起红斑（发红）、水肿（肿胀）和水疱（水泡）等症状。另外，皮肤致敏性与皮肤刺激性的反应不同，免疫系统的过度反应会导致更严重的症状。此外，由于反应涉及到免疫系统，所以从皮肤暴露在致敏物质中到症状的出现是一个复杂的过程。OECD定义了该过程中的四个关键事件：1.蛋白与致敏物质的结合，2.角质细胞的活化，3.树突状细胞的活化，4.T细胞的增殖[8]。
目前，使用较为广泛的in vivo（体内）皮肤致敏测试法就是用小鼠进行的局部淋巴结试验（LLNA，Local Lymph Node Assay），是以关键事件4为基础的评估法。而动物实验替代法收录了6种以除关键事件4外的其他三个关键事件为基础的测试法，包括以关键事件1为基础的直接肽反应试验[9]（DPRA，Direct Peptide Reactivity Assay）（OECD TG442C），以关键事件2为基础的ARE-Nrf2荧光素酶试验[10]（ARE-Nrf2 luciferase test method，KeratinoSens™）（OECD TG442D ; Appendix IA）和ARE-Nrf2 Luciferase LuSens[11]（OECD TG442D；Appendix IB），还有以关键事件3为基础的h-CLAT[4], U937皮肤致敏试验[12]（U-SENS，U937 Skin Sensitization Test）（OECD TG442E；ANNEXⅡ）和 IL-8 Luc试验[13]。
致敏物质进入人体后和蛋白结合，形成复合物，被免疫细胞之中的树突状细胞吸收后，该复合物被视为抗原（异物）。这种蛋白与致敏物质结合形成复合物的过程就是关键事件1，和2015年被收录于TG的DPRA相同，笔者团队开发的ADRA也是一种利用过程来评价反应性的测试法。
◆ADRA和DPRA的原理比较
蛋白与致敏物质的结合，主要是通过蛋白中的巯基，以及半胱氨酸或赖氨酸的氨基的共价结合来实现的[13,14]。因此，DPRA使用含有半胱氨酸的肽和含有赖氨酸的肽，通过这两种肽与待测物质的反应性来评价致敏物质与蛋白的结合性能[15]。
图1. NAC和NAL的结构式
相比之下，ADRA运用了在半胱氨酸和赖氨酸两种氨基酸中引入了带萘环的新型氨基酸衍生物，N-（2-（1-Naphthyl）acetyl）-L-cysteine（NAC）和α-N-（2-（1-Naphthyl）acetyl）-L-lysine（NAL）（图1），通过测试它们与待测待测物质的反应结果来评估致敏物质与蛋白的结合性能[14,15,16]。
测试步骤如下。首先，在96孔板上配制NAC、NAL和待测物质以1:50的摩尔比混合的反应溶液，在25℃中遮光孵育24小时。24小时后加入三氟乙酸（TFA）水溶液终止反应，然后用HPLC检测待测物质和未反应的NAC、NAL的量，从而算出待测物质的NAC、NAL的反应性（图2）。DPRA和ADRA一样，在肽与测试物质反应24小时后，用HPLC定量未反应的肽，以计算待测物质的反应性。
图2. ADRA测试法的流程
与使用培养细胞或生物来源成分的体外（in vitro）测试不同，ADRA 和 DPRA只评价物质的化学反应（in chemico测试），是一种重复性好、精确度高的简易测试法。
尽管基本原理和测试程序相同，但ADRA用NAC和NAL来替代了肽，所以ADRA在许多方面都优于DPRA。
表1. ADRA与DPRA的比较表
ADRA | DPRA | |||||
试剂 | 亲核试剂 | 种类 | NAC | NAL | 含有半胱氨酸的肽 | 含有赖氨酸的肽 |
在反应溶液中的浓度 | 5 µM | 500 µM | ||||
抗氧化剂 | 0.2 µM EDTA | 无需添加 | 无 | 无需添加 | ||
待测物质溶液 | 溶剂的种类 | ①水，②乙腈，③丙酮，④DMSO/乙腈 | ①乙腈，②水，③乙腈/水，④异丙醇，⑤丙酮，⑥丙酮/乙腈，⑦乙腈/ DMSO | |||
在反应溶液中的浓度 | 0.25 mM | 5 mM | 25 mM | |||
缓冲液 | 种类 | 磷酸缓冲液 | 磷酸缓冲液 | 醋酸铵缓冲液 | ||
pH | 8.0 | 10.2 | 7.5 | 10.2 | ||
反应 | 反应容器 | 96孔板 | HPLC用瓶 | |||
亲核试剂所需量 | 约0.3 µg/孔 | 约400 µg/瓶 | ||||
待测物质所需量 （分子量按200计算） | 0.01 mg/孔 | 0.2 mg/瓶 | 1 mg/瓶 | |||
反应液总量 | 200 µL | 1000 µL | ||||
温度 | 25 ℃ | |||||
时间 | 24小时 | |||||
终止反应 | 终止液 | 溶液 | TFA溶液 | 无 | ||
添加量 | 50 µL | |||||
HPLC检测 | 检测波长 | 281 nm | 220 nm | |||
分析时间 | 20分钟/试剂 | 20分钟/试剂 | ||||
EDTA：乙二胺四乙酸
TFA溶液：2.5%（v/v）三氟乙酸水溶液
在DPRA中，反应溶液中待测物质的浓度高达5~20 mM，待测物质经常会出现沉淀的现象，并且需要在220 nm短波长下定量这两种肽，因此会出现与待测物质来源的峰重叠的情况（共出峰），从而无法正确地评估致敏性。
另一方面，由于NAC和NAL具都有萘环，所以它们可以在281 nm处定量，比DPRA长约60 nm。所以几乎不与待测物质来源的峰共出峰。另外，NAC和NAL在HPLC中的检测灵敏度高，反应溶液中待测物质可以在0.2 mM的浓度（浓度为DPRA的1/100）下进行测试，基本上不会析出待测物质。
除此之外，DPRA中含半胱氨酸的肽的氧化和二聚化会降低定量的准确度，但作者发现，金属离子会参与巯基的氧化，所以在ADRA中向NAC的反应溶液加入极微量的EDTA，能改善NAC的稳定性[17]。
DPRA中含半胱氨酸肽的二聚体在反应溶液中的析出可能会影响HPLC的检测，而且不能对它的二聚化进行定量。而在ADRA中，可以通过HPLC定量而不会析出NAC二聚体，即使NAC发生氧化，也能容易判断出对测试系统的影响。
除了上述要点之外，ADRA还能在HPLC的检测过程中添加终止液来抑制反应的进行，获得比DPRA误差更少且更稳定的数据，与在HPLC瓶中配制反应溶液的DPRA不同，ADRA使用96孔板和多通道移液器，可实现高通量，是一种通用性好、操作性优越的高精确度测试法。
◆ADRA的致敏评估能力
动物实验替代法需要进行与动物实验相同的安全性评估。为了确认ADRA和动物实验一样能对化学物质进行皮肤致敏评估，作者用建立DPRA测试法时使用过的82种物质对LLNA进行预测准确度评估。结果显示ADRA的预测准确度高达87%[18]。
综上，ADRA是一种非常有效的测试法，自2016年以来，作者一直致力于将ADRA收录在OECD测试指南中。2017年，四所研究机构参与了评估ADRA重复性与有效性的验证实验，而该实验在相同仪器与不同仪器间也获得了非常高的可重复性。目前，作者正根据此结果申请将ADRA收录于测试指南中。
◆今后的展望
如本文所述，ADRA在很多方面都优于DPRA，与其他体外替代法相比，无需使用培养细胞的ADRA还具有众多优点，如无需使用特殊设施、设备及无菌操作等技术，测试周期短、价格低、重复性良好等。
欧盟禁止化妆品原料进行动物实验后，化妆品行业对动物实验替代法的需求不断提高；另外，在REACH法规修订后，动物实验替代法也被纳入到除化妆品原料外的一般化学品的安全性评估中。今后，ADRA有望在化妆品行业以外等更广泛的领域中得到进一步应用。
◆关键词
3R原则
指"Replacement：替换为不使用动物的方法"、""Reduction：减少动物数量的使用"和"Refinement：减轻实验对动物带来的痛苦"的3点动物实验原则。
◆参考文献
| [1] | EU化粧品指令 (第7次改正) European Commission : "DIRECTIVE 2003/15/EC OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 27 February 2003，amending Council Directive 76/768/EEC on the approximation of the laws of the Member States relating to cosmetic products", Official J. European Union, L66/26 (2003). |
| [2] | 環境省告示，「動物の愛護及び管理に関する施策を総合的に推進するための基本的な指針」，平成 25 年 8 月30日，第 80 号 (2013). |
| [3] | OECD : "Short Time Exposure In Vitro Test Method for Identifying I） Chemicals Inducing Serious Eye Damage and II）Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 491 (2018). |
| [4] | OECD : "ANNEX Ⅰ : In Vitro Skin Sensitisation : Human Cell Line Activation Test (h-CLAT)", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 442E (2018). |
| [5] | OECD : "ANNEX Ⅲ : In Vitro Skin Sensitisation : IL-8 Luc assay", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 442E (2018). |
| [6] | OECD : "In Vitro Skin Irritation : Reconstructed Human Epidermis Test Method", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 439 (2013). |
| [7] | OECD : "Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 492 (2018). |
| [8] | OECD : OECD Series on Testing and Assessment, 168, 1 (2014). |
| [9] | OECD : "In Chemico Skin Sensitisation: Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA)", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 442C (2015). |
| [10] | OECD : "Appendix IA : In Vitro Skin Sensitisation : The ARE-Nrf2 Luciferase KeratinoSens™ Test Method", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 442D (2018). |
| [11] | OECD : "Appendix IB : In Vitro Skin Sensitisation : The ARE-Nrf2 Luciferase LuSens Test Method", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 442D (2018). |
| [12] | OECD : "ANNEX Ⅱ : In Vitro Skin Sensitisation : U937 Cell Line Activation Test （U-SENS™）", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 442E (2018). |
| [13] | Roberts D. W. et al. : Chem. Res. Toxicol., 20, 1019 (2007). |
| [14] | Ahlfors, S. R. et al. : Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol., 16, 59 (2003). |
| [15] | Gerberick, G. F. et al. :Toxicol. Sci., 97, 417 (2007). |
| [16] | Fujita M. et al. : J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 70, 94 (2014). |
| [17] | Yamamoto Y. et al. : J. Appl. Toxicol., 35, 1348 (2015). |
| [18] | Fujita M. et al. : J. Appl. Toxicol., in press, (2018). |
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