外泌体的冻存

近来关于细胞外RNA（exRNA）和细胞外囊泡（EV）报道的涌现，凸显了外泌体及其内含物作为疾病和治疗靶标的生物标志物的潜力，其中突出应用集中在在肿瘤学领域。目前越来越多的科研经费注入到EV的研究中来。

长久以来，虽然已有一些研究表明目前不同储存条件对外泌体存在影响，但外泌体保存条件的标准仍未定义有统一定论。上海交通大学研究了不同pH、温度和冻融次数等储存条件对外泌体的数量变化和细胞摄取的影响并于2019年4月发表在Protein & Cell杂志上。研究人员将提取得到的外泌体等分成若干等分，每个部分在不同温度（-80℃， -20℃，4℃，37℃和60℃）下储存，或通过1-5个循环冷冻至-80℃并解冻。24小时后，进行NTA和WB检测外泌体的剩余量。

（A）通过NTA检测在不同温度下储存24小时的外泌体的相对浓度。

（B）在样品在不同条件下储存24小时后，

通过WB检测三种外泌体标记物TSG101，HSP70和ALIX的水平。

(A)(B)图的结果显示在4℃下储存的外泌体具有最高浓度。

（C）在外泌体储存于−80 °C，−20 °C及4 °C 下0，7，15及30天后，

通过WB检测三种外泌体标记物TSG101，HSP70和ALIX的水平。

（C）图中检测了在不同温度（-80℃，-20℃，4℃）下长期储存的外泌体相关蛋白的水平。ALIX，HSP70和TSG101的水平随储存时间延长而显出下降趋势，在-20℃和4℃的降解速度大于-80℃下的蛋白降解速度。在4℃下放一个月，外泌体上的标记蛋白几乎完全降解。

（D）不同的冻存次数下外泌体标记物TSG101，HSP70和ALIX的水平。

（D）图表明反复冻融会造成外泌体标记物水平的降低，其可能的机制是造成了膜的破坏。

那么问题来了，如何合适的呈现浓度和适宜保存条件之间取得理想平衡呢？

FUJIFILM Wako推出的EV-Save™ 细胞外囊泡吸附抑制剂（产品编号：058-09261）是一种新型添加剂，能有效防止外泌体吸附在塑料耗材与超滤管上而造成颗粒数的损失。研究发现，EV-Save™ 还能抑制外泌体在低温和冻融下所受到的损伤。

◆实验条件

用MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS提取COLO201细胞来源的外泌体，然后进行冻融。再进行PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（抗小鼠IgG POD）（产品编号：297-79201）检测（图E），和透射电镜（TEM）分析（图F）。

（E）

（F）

◆结果

冻融后CD63信号减弱，但是添加 EV-Save™ 后这种减弱的情况得到抑制（图E）。此外，电子显微镜分析结果（图F）表明冻融导致了颗粒数明显减少，但是通过添加EV-Save™ 可以起到抑制颗粒数减少的作用。

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