第四回 肽和蛋白定量的新技术

第一三共株式会社 研究开发总部 药物动态研究所合田 竜弥

◆前言

由氨基酸组成的肽和蛋白是基因的最终产物，直接控制着细胞的形态和功能。因此，由癌变等引起的细胞形态和功能的变化过程中，单个肽和蛋白的表达水平、翻译后修饰等指标也会发生变化。这些变化可以作为生物标志物用于对患者进行分层，对疾病进行早期诊断，以及对药效进行评价，从而对病理进行研究。这些研究中，需要对肽和蛋白在个体内以及个体间的差异进行测定，因此能检测出尽可能小的差异的定量方法十分重要。

另外，肽和蛋白也被用作新式药物。其中的代表案例就是抗体药物。目前的药物开发研究中，研究方向逐渐从以小分子化合物为中心的制药转变为以抗体药物为代表的生物制药，并且抗体药物的销售额已居世界前列。另外，包含小分子肽在内的一些中分子药物，由于其能够与一些不能与小分子药物和抗体药物结合的新型靶点结合，因此对其的研究也在积极地开展中，它作为下一代的药物被给予高期望。同样地，也需要有一种能够精确地定量肽和蛋白的定量方法，来对其进行分析。

然而，具有多个氨基酸的肽和蛋白质可能会形成各种高级结构，与小分子化合物氨基酸的物性有很大的差异。尤其是可能会出现吸附和凝集等现象，所以在分析处理上要十分注意。这些性质在液相色谱分析（LC）中会造成峰形差，柱填充剂的回收率低，难以高灵敏定量等问题，因此，为了定量肽和蛋白，需要采取与小分子化合物氨基酸分析完全不同的研究方法。

对于肽和蛋白定量的新技术，通过改变其前处理法，使用的容器和色谱柱等条件，已经设计出了各种方法以用于分析中。本文将向大家介绍一种新的定量技术——肽吸附控制的LC分析（Peptide Adsorption-Controlled LC, PAC-LC）。

◆LC分析中肽的吸附影响

如上所述，肽和蛋白的吸附使得精确定量很困难，因此难以进行高灵敏度的定量。

例如，使用40个氨基酸残基，分子量为4,696的肽——尿皮素，乙腈含量不同的100 μL 尿皮素溶液（1 nM）导入LC时获得的SRM（选择反应监测模式）色谱图为图1A，保留在柱上的尿皮素峰面积值为图1B。如图所示，仅用水无法检测出稀释溶液中的尿皮素峰。然而无论是添加了哪种酸，结果都表明尿皮素因吸附于容器、枪头、针而造成损失，因此这样的操作方法是无法检测出纳摩尔（nM）级别的待测物的。

另一方面，通过添加乙腈可以检测出尿皮素的峰，但是保留在柱中的尿皮素的峰（下文简称为保留峰）的面积值不稳定。这是因为，乙腈含量达到30%时，尿皮素对容器、枪头、针等的吸附无法完全回避。另外，乙腈含量达到40%以上时，尿皮素对容器等的吸附虽然可以避免，但是会出现完全不保留尿皮素的峰的情况（下文简称为非保留峰），从而引起保留峰面积的减少。因此，为了定量尿皮素，需要完全避免吸附，可使用可以检测到单峰尿皮素的含量30%的乙腈溶液。然而，尿皮素的吸附程度会随时间而发生变化；另外，由于还受其他的共存成分的影响，如在活体样品这样的基质复杂的样品的检测，难以将乙腈的最适含量定为30％。

图1.　乙腈含量不同的尿皮素溶液（1 nM）的SRM色谱以及保留峰面积（B）

◆肽吸附能力的相变现象

上述所说的现象，在分子量为1,007~45k的各种肽和蛋白中都能被观察得到，并且除乙腈外，还有甲醇，乙醇，乙酸，甲酸等溶剂能引起上述现象^1）。因此，在样品溶液中增加有机溶剂含量，产生保留峰之外的非保留峰的现象是肽和蛋白的普遍会发生的一种现象。

要解释这个普遍现象，就要考虑在特定的有机溶剂含量（临界值）下，肽和蛋白对柱填充剂的吸附能力会突然且可逆性地发生变化（相变）这个因素（图2）。

也就是说，考虑到管内径以及流速，导入到LC的100 μL 中的大部分尿皮素溶液在流入液相色谱柱的同时，其溶液组分会被色谱柱保留。这种情况下，由于溶液中的乙腈含量较高，尿皮素丧失了对填充剂的吸附能力，它会直接通过色谱柱，作为非保留峰被洗脱出来。另一种情况是，当尿皮素溶液流经色谱柱时，由于溶液与流动相混合，尿皮素溶液中的乙腈含量降低，尿皮素对柱填充剂的吸附能力瞬间得以恢复，因此能保留在柱中，结果，尿皮素作为保留峰被洗脱出。

根据这一理论，从图1A的色谱中推断尿皮素能吸附在柱填充剂的乙腈含量临界值在30~40%之间。圆二色（CD）光谱分析显示，这与引起尿皮素产生高级结构变化时的乙腈临界值相同^2）。同时，这也显示出该高结构变化是可逆的，由此可认为，对尿皮素对柱填充剂的吸附能力的急剧变化有可能是与其高级结构的变化是有关的。

蛋白和肽的吸附能力的相变现象也能通过反相分离法得到解释： “最初分布并保留在柱入口附近的固定相表面的蛋白与肽，当流动相中的有机溶剂浓度达到一定值时，就开始从固定相中脱附，一旦脱附，就直接从柱中洗脱出而不与固定相有任何相互作用。”然而，因为高级结构可逆性会带来的吸附能力的可逆性，所以有观点认为有机溶剂含量为临界值的洗脱液中的肽和蛋白，会在附近的固定相的表面重复地进行吸附和脱附。

图2.　肽的吸附能力相变理论

图3.　2液以及3液PAC-LC

◆肽吸附控制LC的开发

上述部分所阐述的是通过改变有机溶剂含量来改变肽的吸附能力的相变现象，可以更准确以及更灵敏地定量肽，从而开发了肽吸附控制LC（Peptide Adsorption-Controlled LC, PAC-LC）（图3）^2-4）。

PAC-LC与标准的LC相比，水流动相用的泵位置不同，它是一种在柱前混合水流动相的系统。虽然也可以使用2液系统，但3液系统使用时的优点是，在传统LC使用3液系统时，无需更换连接线路。

PAC-LC的特点是，通过在柱入口前与水流动相混合，可以强制改变进样的肽周围的有机溶剂的含量。例如，乙腈含量50%的肽溶液在100%水流动相A和有机溶剂流动相B（3液系统时，流动相为B和C）的混合比为9：1的条件下进样时，到达柱时的肽周围的乙腈含量为5%。当使肽有吸附能力的乙腈临界值在20%的情况下，在溶液导入柱前溶液中的肽是没有吸附能力；而进样后，溶液中的乙腈含量为5%，肽对柱填充剂的吸附能力瞬间恢复，从而保留在柱内。另一方面，乙腈含量为50%的溶液中的肽也不会对容器、枪头、针等有吸附能力，意味着可以确保操作过程以及LC进样过程的定量准确性。

实际上，使用PAC-LC检测乙腈含量不同的尿皮素溶液时，尿皮素通常被检测出一个保留峰，并且当使用乙腈含量比临界值（30~40%）大的的溶液检测时可以获得几乎相同的峰面积值（图4）。另外，用乙腈含量为50%的溶液制备的尿皮素标准曲线样品的峰面积与浓度成一定比例；另外标准曲线在10 pM至10 nM的浓度范围中有着良好的准确度（与理论值的误差为±15％）^2）。并且，乙腈含量为可以避免肽吸附的的样品进行重复检测时，有着良好的检测精度（误差小于10%），该精度与乙腈具体的含量无关^3）。因此通过使用乙腈含量在临界值以上的溶液可以避免样品制备时以及进样时的吸附；另外，由于使用PAC-LC可以检测出单峰，所以可以进行高精度的检测。

另一方面，在使用传统LC时，即使使用的是标准溶液，非保留峰与保留峰的比的不规则变化会损害检测精度^3）。这是因为到达柱前，标准溶液和流动相混合不均而造成的。因此为了正确地定量，使用能检测出单峰的，有机溶剂含量接近临界值的溶液是有必要的。该事实也表明传统LC要同时高精度地定量临界值差异大的不同种的肽和蛋白是十分困难的。

如上所述，PAC-LC与传统LC相比，PAC-LC在测定时能检出的有机溶剂含量的范围更广，能以更高的检测精度来定量样品溶液；除此之外，PAC-LC还具有可以同时高精度地检测临界值不同的多种肽这一大优点。

图4. 用乙腈含量不同的尿皮素溶液检测是的峰面积

◆使用PAC-LC定量活体样本中的肽和蛋白

近年来，通过将基因重组技术应用于免疫球蛋白（IgG、IgM、IgD、IgE、IgA）而制得抗体药物。上市的所有抗体药物都有以IgG为基准的氨基酸序列。最近，研究人员在积极地研究利用胰蛋白酶消化法^5）对动物和人血浆中的抗体药物定量的方法，但是为了将抗体药物与内源IgG和杂质成分进行区分，需要选择合适的肽片段。使用PAC-LC时，由于可以对通过胰蛋白酶消化获得的各种特性的肽片段同时进行准确的检测，因此可以轻松地对消化条件和LC条件的进行优化，从而可以有效地获得理想的肽片段。另外，在实际样品检测中，还可以通过同时检测多个肽来评估抗体药物在活体内的结构变化（生物转化）。

另外，在定量淀粉样蛋白肽——阿尔茨海默病的主要病理特征之一的老人斑的主要组成成分时，为了避免吸附，只需进行在含有酸和有机溶剂的溶液中稀释CSF（脑脊液）这样简单的前处理，就可以利用PAC-LC同时定量犬类CSF中的4种β-淀粉样蛋白肽^4）。

因此，利用肽和蛋白的吸附能力的相变现象的PAC-LC，是定量活体样品中肽和蛋白的有效工具。

◆结语

以往，肽和蛋白的定量往往会使用抗体与靶点特异性结合的配体结合法。然而，这种方法除了抗体制备需要时间且不能保证制备成功之外，还存在交叉反应性等问题，有时候定量值的解释也会很复杂。相比之下，LC/MS法具有基于m/z和保留时间的高选择性，从可以正确地定量目标这一点来看，LC/MS是一种非常优秀的分析方法。如今，肽和蛋白不仅仅是作为生物标志物，在生物制药方面的应用也备受关注，因此需要各种检测技术对其进行检测。希望通过运用PAC-LC这样的新技术，在今后的研究中取得更多的进展。

◆参考文献

1）Goda, R. et al. :Biomed. Chromatogr.,22, 81 （2008）.

2）Goda, R, et al. : Biomed. Chromatogr.,21, 1005 （2007）.

3）Goda, R, et al. : Biomed. Chromatogr.,22, 857 （2008）.

4）Goda, R, et al. : J Chromatogr. B., 895, 137 （2012）.

5）Hashii, N. et al. :Chromatography, 39, 7 （2018）

◆产品列表

FUJIFILM Wako提供高灵敏度MS用超高纯度乙腈溶剂，品质保证，经多变量分析来确保符合分析要求。