新型组织化学染色脱色法

本文摘自和光纯药时报 Vol.87 No.4（2019年10月号），由麻布大学兽医学部 解剖第二研究室 小泽秋沙执笔撰写。

本法是一种可使临床检查或研究中最常用的组织化学染色苏木精-伊红（HE）或Masson法（MT）染色的组织切片脱色，并可重新用于其他染色的方法。

迄今为止，每一种组织化学染色通常都需要使用至少一片组织切片，因此必须准备与组织化学染色方法相对应数量的组织切片。然而，由于制备组织切片时的技术熟练度以及组织样品状态、大小等原因，有时很难备齐多个适合评价的组织切片。另外，在评价同一细胞时一般使用连续切片的方法，然而即使获得了合适的连续切片，想要观察的组织结构和细胞内结构，也可能不同时存在于两个相邻的组织切片上。

在这种情况下，重复利用已有观察特征的细胞或结构的组织切片就会十分有用。HE染色可获取组织大致特征，因此是首次染色的代表染色法之一，如果可以对HE染色后的目标结构的组织切片进行重新染色，便可以提高临床检查以及研究结果的准确性。

至今为止，组织切片脱色通常使用乙醇与盐酸的混合溶液、含有草酸、高锰酸钾的溶液。然而，这些脱色方法都会影响组织切片在脱色后的再染色效果。

实际上，在乙醇中加入盐酸的溶液不能对苏木精等染料充分脱色。而通过高锰酸钾、草酸脱色则会对组织切片造成很大的损害，重新染色时组织结构可能会因为切片剥离被破坏，从而限定了再染色的方法，也限制了组织切片的再利用。因此，学界期待开发一种几乎不会损害组织切片，并且可以对多种染色法进行脱色后再染色的全新方法。

这次，FUJIFILM Wako开发的deColorizing Solution，可以对HE染色后确认了组织状态（特定的结构及细胞的存在）的切片脱色，再重新用于其他染色，从而能够从同一组织切片中获得更多信息。该方法的特点在于可以对原本难以脱色的苏木精、铁苏木精进行脱色。

使用方法：首先将染色后密封的载玻片标本浸入二甲苯等有机溶剂中，直至盖玻片自然剥落。请注意，在此过程中若是强行分离盖玻片可能会破坏组织切片。

另外，若在组织切片上仍然残留有封固剂的状态下就进行下一步骤，水溶性色素在水合后不会脱落，会降低随后使用deColorizing Solution进行脱色的效果，因此必须使用二甲苯等有机溶剂充分浸泡。必须注意的是，标本越旧，封固剂的固化越牢固，封固剂就越难去除。

其次，将组织切片依次用各种浓度的乙醇进行水合，最后浸入蒸馏水中。在水合过程中，伊红等水溶性色素基本脱色，组织切片上仅残留染色的苏木精。将残留苏木精染色的组织切片浸入按照使用浓度稀释的deColorizing Solution 1中。脱色主要取决于组织切片染色后保存的时长，但苏木精在室温下于deColorizing Solution 1中浸渍1 h基本就能脱色。

铁苏木精脱色时需要在deColorizing Solution 1中浸渍1 h后使用蒸馏水清洗3次，然后浸渍于deColorizing Solution 2。通过光学显微镜确认脱色程度（染色残留情况），确认不会影响下次染色后，浸渍于蒸馏水并清洗3次，这时可用于重新染色。

目前，在使用deColorizing Solution脱色后，可以使用的再染色方法已确认的有HE染色、PAS染色、MT染色和免疫组织化学染色。

图1和图2分别是小鼠海马体以及肝脏在HE染色后使用deColorizing Solution按照上述步骤脱色后的图片。如图１A及图２A所见，包括细胞核在内，被苏木精染色的部分在图1B及图2B中大部分已被脱色。

图1.  使用deColorizing Solution 1脱色HE 染色后的组织切片并重新染色

A：HE染色的小鼠海马体组织图像

B：使用deColorizing Solution 1脱色后与A相同位置的组织图像

C：脱色后使用抗Iba1抗体进行荧光免疫组织化学染色后与A和B相同位置的组织图像

图2. 使用deColorizing Solution 1脱色HE 染色后的组织切片并重新染色

A：HE染色的小鼠肝脏组织图像

B：使用deColorizing Solution 1脱色后与A相同位置的组织图像

C：脱色后使用抗PCNA抗体进行免疫组织化学染色后与A和B相同位置的组织图像

另外，图3为小鼠肝脏以及肾脏在MT染色后使用deColorizing Solution 1和2脱色后的图像。图3A和C中包括细胞核在内，被铁苏木精染色的大部分在图3B和D中均已完全脱色。

图3. 使用deColorizing Solution 1和2对MT 染色后的组织切片脱色

A：MT染色后的小鼠肝脏组织图像

B：使用deColorizing Solution 1和2脱色后与A相同位置的组织图像

C：MT染色后的小鼠肾脏的组织图像

D：使用deColorizing Solution 1和2脱色后与C相同位置的组织图像

图1C为小鼠海马体脱色后使用抗Iba1抗体（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）进行免疫组织化学染色的图片，图1A和B为同一位置的图像。如图可见，脱色后的海马体切片仍然可以检测出Iba1阳性小胶质细胞突起。图2C为小鼠肝脏脱色后使用抗PCNA抗体进行免疫组织化学染色的图片。如图可见，阳性PCNA主要在肝细胞的细胞核中表达。

另外，并未发现因脱色导致的组织切片破坏等损伤。

该方法的优点在于，大量长期保存在大学、研究所、医院等的珍稀组织切片，在制备时没有新型染色方法以及针对新型抗原的抗体，通过再染色等方法可以重新评价以获取新的实验信息。

目前，deColorizing Solution的应用只适用于HE 染色和MT 染色后的脱色，但随着该方法的应用范围拓展，脱色法在重复使用组织切片方面的实用性将进一步提高。

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