第二回 开发运用牙龈干细胞来源外泌体治疗牙周炎

干细胞来源EV ~治疗，诊断，化妆品的开发~

九州大学医院 牙周科 福田隆男

◆前言

牙周炎是由口腔内的牙周病细菌引起的一种慢性炎症，其特征为支持牙齿的牙槽发生骨吸收（bone absorption）。然而，一般的牙周炎治疗侧重于病因消除疗法，主要清除牙菌斑以及菌斑所在的牙结石。因此，现阶段只能采取抑制病症进展的疗法，而因牙周炎损失的牙槽骨却无法再生。

为了改变这一现状，现针对牙周组织再生的疗法开发已经在进行中。迄今为止，已经制定出多种方案，虽然取得了一定成果，但适用症状还存在一定局限。另一方面，近年来备受大家关注的以干细胞为中心、基于细胞移植的细胞治疗取得了显著疗效，但受设备要求和成本限制，其在临床口腔医学中的广泛应用仍存在许多障碍。在任何治疗中，建立统一观点的分子基础对进一步提高安全性与疗效非常重要。

在细胞治疗中间充质干细胞（MSCs）是主要的细胞来源代表。近年来，基于一直以来的细胞治疗概念，干细胞分泌因子的影响也受到越来越多的关注。换言之，从MSCs分泌的外泌体在MSCs对疾病的治疗效果中起着核心作用，并且还发现通过内含的miRNA调节基因表达对组织再生的重要性^1）。牙龈干细胞(GMSCs)与其他组织来源的MSCs相比更容易采集，且具有优越的免疫调节能力²⁾，以及高外泌体分泌量的特点³⁾。MSCs的来源外泌体由于可长期冻存，在临床应用方面颇具优势，并且由于不属于细胞治疗，在道德方面的阻碍也相对低。因此，我们目前正在进行GMSCs来源外泌体应用于治疗牙周病的基础研究^4）。

◆GMSCs来源外泌体对M2巨噬细胞的诱导

巨噬细胞在牙周炎的每个阶段都存在不同的表型^5）。巨噬细胞大致可分为两种表型，炎症诱导的M1巨噬细胞和抗炎的M2巨噬细胞。M1巨噬细胞被Th1细胞因子（如LPS或IFN-γ）激活，产生炎症诱导因子iNOS、ROS、TNF-α、IL-1β和IL-6等。相反，M2巨噬细胞被Th2细胞因子（如IL-4、IL-13）诱导，并通过产生IL-10、TGFβ和VEGF等抗炎细胞因子，促进血管生成和清除，在炎症反应收敛和向组织修复转化的阶段发挥核心作用。

为验证GMSCs来源外泌体具有的抗炎作用，检测了它们对巨噬细胞表型的影响。结果显示，其与IL-4/13刺激作用相同，可诱导M2巨噬细胞。据报道，MSCs在应对疾病来源的刺激时，会提升其治疗效果^6）。因此，在对GMSCs施加各种炎症刺激后，从培养上清液中回收外泌体，并比较它们诱导M2巨噬细胞的能力。结果证实，TNF-α刺激诱导M2巨噬细胞的效果最佳^4）。为进一步进行in vivo验证，在小鼠背侧皮下制造了表皮缺损，并注射GMSCs来源外泌体，以比较随时间变化伤口愈合的效果。与对照组（PBS）相比，外泌体组观察到明显的伤口愈合，但在TNF-α刺激后，进一步显示出外泌体组促进伤口愈合的效果。在此时的组织切片中，也观察到在TNF-α刺激后，外泌体组中M2巨噬细胞的早期聚集，以及炎细胞浸润的早期减少和伤口上皮化的亢进^4）。

◆GMSCs来源的外泌体对牙周炎治疗的效果

为了验证GMSCs来源外泌体通过诱导M2巨噬细胞治疗牙周炎的可行性，制备丝线结扎诱发的小鼠牙周炎模型，并测试其抑制牙槽骨吸收的能力（图1）。结果显示，将外泌体注入牙龈可抑制牙槽的骨吸收，而在TNF-α刺激后，外泌体组对骨吸收的抑制作用得到进一步提高。组织成像也显示TRAP阳性破骨细胞数量的减少^4）。

图1. 抑制牙周炎小鼠模型中的牙槽骨吸收的效果（改编自参考文献4）。

M2巨噬细胞的IL-4/13刺激以外的诱导路径，近年有报告称其为腺苷（ADO）及其受体介导的分化路径^7）。ADO是抗炎分子的一种，由炎症反应诱导产生的三磷酸腺苷（ATP），通过细胞膜酶CD39/CD73的去磷酸化级联反应所产生。CD73作为代表性的MSC阳性标志物也在GMSCs中长期表达，但它在外泌体中的表达会在TNF-α的刺激下增强。另外，用CD73中和抗体处理外泌体可显著抑制M2巨噬细胞的诱导。这些结果表明，由TNF-α刺激GMSCs诱导的外泌体CD73对诱导M2巨噬细胞非常重要^4）。

◆GMSCs来源外泌体包裹的miR-1260b对骨吸收的抑制

为了研究GMSCs来源外泌体抑制骨吸收的机制，对外泌体包裹的miRNA进行了微阵列分析。以TNF-α诱导的miRNA为重点进行数据库分析显示，miR-1260b以大量骨吸收相关的基因为靶向。因此，使用牙周韧带细胞（PDLCs）研究miR-1260b导入对破骨细胞激活因子RANKL表达的影响。结果证实，LPS诱导的RANKL表达不仅被GMSCs来源的外泌体刺激，还被miR-1260b导入显著抑制。对这些分子机制进行验证后发现，TNF-α诱导的miR-1260b通过抑制Wnt5a和JNK信号，进而抑制PDLCs中RANKL的表达^4）。

图2. 用TNF-α刺激的GMSCs来源外泌体（Exo-TNF）治疗牙周炎的模型（改编自参考文献4）

◆结语

在牙周炎的治疗中，M2巨噬细胞在收敛炎症和诱导组织修复方面发挥核心作用。此外，最近有报道称，牙周韧带干细胞（PDLSCs）与M2巨噬细胞共同培养可促进其向成牙骨质细胞分化，后者对牙周组织的再生非常重要^8），同时还可建立M2巨噬细胞对牙周组织有再生作用的依据。因此，除了对治疗牙周炎时至关重要的收敛炎症外，GMSC来源外泌体还有可能诱导组织重塑和再生，这将为牙周组织的再生带来明显优势（图2）。

此外，对GMSCs来源外泌体中包裹的miRNAs进行Ingenuity Pathway Analysis证实，其在生活方式病和疑难杂症中具有潜在应用价值的众多途径的备选方案里位居前列。未来，通过阐明由GMSCs来源外泌体中的miRNA所介导的抗炎作用机制，为今后的人体研究建立分子基础，并从应用于牙周病的治疗出发， 以达到"从口腔到全身健康 "治疗策略的目标。

◆参考文献

1）Quesenberry, P. J .et al. : Stem Cell Res.Ther., 6, 153（2015）.

2）Zhang, Q. et al. : J. Immunol., 183, 7787（2009）.

3）Kou, X. et al. : Sci. Transl. Med., 10, eaai8524 （2018）.

4）Nakao, Y. et al. : Acta Biomater., 122, 306 （2021）.

5）Ebersole, J. L. et al. : Periodontol. 2000, 62, 163（2013）.

6）Katsuda, T. et al. : Proteomics , 13, 1637 （2013）.

7）Csóka, B. et al. : FASEB J., 26, 376（2012）.

8）Li, X. et al. : Stem Cells, 37, 1567（2019）.

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