【技术报告】基于基因重组技术开发的内毒素检测试剂

富士胶片和光纯药株式会社 生物技术中心 福地大树

◆前言

内毒素，是存在革兰氏阴性菌细胞壁外膜的一种脂多糖（Lipopolysaccharide），仅需微量进入血液便可引发发热症状，大量存在时则表现出强烈的毒性，甚至导致内毒素休克和死亡^1）。鉴于革兰氏阴性菌在环境中的广泛分布及其可能混入生产过程，加之内毒素的耐热性和不易灭活特性，对注射剂和医疗器械实施内毒素污染管理显得尤为重要。近年来，随着再生医疗、疫苗、抗体及核酸药物等相关产品的蓬勃发展，内毒素管理在这些产品中的重要性也日益凸显。

目前，内毒素的检测主要依赖于利用鲎血细胞提取物凝固系统的鲎试剂（LAL/TAL）。然而，为了保护鲎资源、确保鲎试剂稳定供应、减少产品批间差异及提高检测稳定性，各鲎试剂厂家正积极使用人工原料生产的基因重组蛋白来开发重组鲎试剂（rLAL）。

◆内毒素测试法的检测原理

内毒素测试法是使用由鲎血细胞成分制备的鲎试剂进行内毒素检测或定量的方法。鲎的血细胞提取物成分中存在使内毒素凝固的反应体系，这种凝固反应基于多个丝氨酸蛋白酶前体依次活化的级联反应（图1）。内毒素激活鲎血细胞提取物中含有的C因子，随后活化C因子激活B因子。然后，活化B因子再激活凝固酶前体，活化的凝固酶通过水解底物凝固蛋白原，将其转化为凝固素，形成不溶性凝胶并凝固。在鲎血细胞提取成分中还存以G因子为起点，与β-葡聚糖发生反应的级联反应，该反应也会引起凝固反应。为实现内毒素的特异性检测，需去除G因子或抑制以G因子为起点的级联反应。

图1 由内毒素、β-葡聚糖引起的凝固级联反应

◆使用基因重组蛋白的重组鲎试剂（rLAL）试剂

目前已商业化的rLAL试剂有两种，一种是重组C因子试剂（rFC），仅使用参与内毒素级联反应三因子中的C因子；另一种是重组级联试剂（rCR），使用与LAL试剂相同的3因子（C因子、B因子、凝固酶前体）。与rCR相比，rFC的单次检测成本低，但是灵敏度较差，需要使用荧光底物的荧光检测和检测仪。而rCR的灵敏度更高，可发生显色发应，因此和天然鲎试剂一样可使用酶标仪进行检测。近年来，有报告称B因子对于内毒素的特异性有着重要作用^2）3），因此使用含有C因子、B因子和凝固酶前体的rCR来检测内毒素具有重要意义。FUJIFILM Wako于2022年推出了rCR试剂PYROSTAR™ Neo。

◆PYROSTAR™ Neo的特点与改进

PYROSTAR™ Neo是一款高灵敏度重组级联试剂（rCR），可定量检测低至 0.001 EU/mL的内毒素，且操作简单，只需将冻干粉末溶解于试验用水即可，溶解后也具有优异的稳定性。另一方面，由各研究机构和鲎试剂厂家组成的重组鲎试剂共同研究小组在该产品上市后实施的评估结果表明，PYROSTAR™ Neo在部分水样中对天然内毒素的反应性低于天然鲎试剂⁴⁾。由于生产用水占内毒素检测的比例较高，因此从安全角度来看，对天然内毒素的反应性低有待改进。针对这一问题，FUJIFILM Wako于2024 年 6月推出了PYROSTAR™ Neo+ 的改良版——PYROSTAR™ Neo＋。

（点击图片查看更多）

◆PYROSTAR™ Neo＋

重组级联试剂（rCR）PYROSTAR™ Neo＋，不仅继承了前代PYROSTAR™ Neo的高灵敏度、操作简便、溶解后稳定性优异的特点，还提高了对天然内毒素的反应性（PYROSTAR™ Neo存在的问题）。通过对从日本全国各地采集的自来水样品中的天然内毒素进行验证测试，结果显示，与PYROSTAR™ Neo相比，PYROSTAR™ Neo＋的反应性更高，且与天然鲎试剂（ES-F）具有相同的反应性（图2）。由于生产用水占内毒素检测的比例较高，从安全角度考虑，PYROSTAR™ Neo＋对水中内毒素的良好反应性具有重要意义。此外，PYROSTAR™ Neo＋另一大特点是在药物检测中，标准曲线可靠，并可检测多种药物。

图2 对水中天然内毒素反应性的对比结果

◆结语

目前，天然鲎试剂仍是内毒素检测的主流试剂，而利用人工原料合成基因重组蛋白的重组鲎试剂的历史较短，有待进一步普及。国际上主流药典对使用重组鲎试剂进行内毒素检测的监管情况如下：

· 2021年，欧洲药典正式收录了利用荧光法的基因重组C因子试剂（rFC）。

· 第十八版（最新版）日本药典的参考信息中记载了“使用基因重组蛋白作为内毒素测试法和检测试剂的替代法”。

此外，美国药典将于2025年5月新增允许使用重组鲎试剂（rCR、rFC）进行内毒素检测的章节，因此重组鲎试剂备受关注。这些发展可能会加速欧洲药典追加收录rCR，以及日本药典对重组鲎试剂（rCR、rFC）的正式收录。目前有关鲎试剂和重组鲎试剂的比较正在不断推进^4）5），今后可能会持续推进重组鲎试剂的使用，但需满足制药企业等用户的具体需求以推动重组鲎试剂的实际应用，从而实现用户利益与环境保护（包括鲎类生物保护）的平衡。‌

参考文献

1）棚元憲一：国立医薬品食品衛生研究所報告, 126, 19 (2008).

2）Kobayashi,Y. et al. : J. Biol. Chem., 290, 19379 (2015).

3）Tsuchiya. M. : Int. J. Dev. Res. 10, 36751 (2020).

4）菊池裕 他：医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス, 54 (4), 341 (2023).

5）菊池裕 他：医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス, 48 (4), 252 (2017).

◆产品列表

点击此处查看相关产品：PYROSTAR™ Neo+