第五回 准确开发细胞外囊泡治疗和诊断标志物的重要性

干细胞来源EV ~治疗，诊断，化妆品的开发~

新潟大学大学院 医齿学综合研究科 消化器内科学领域 土屋淳纪老师

◆前言

近年，由人、植物、果实、细菌和酵母等各类细胞释放的细胞外囊泡（extracellular vesicles）已被证明是生命活动信息传递的重要手段之一，其应用于疾病诊断和治疗的研究也在不断发展。其中，细胞外囊泡粒径为100 nm左右的超小型细胞外囊泡（small extracellular vesicles，以下简称sEVs，日本常称为外泌体）尤其备受关注。这些细胞外囊泡被脂质双层膜包裹，非常稳定，并且因其内部含有大量蛋白质和核酸（如miRNA），作为新型治疗和诊断工具备受关注^1）。本文将介绍笔者在研究sEVs生物标志物开发和治疗开发的过程中，FUJIFILM Wako的产品在关键点上提供的帮助及相关性。

◆使用间充质干细胞的sEVs开发治疗方法的可行性

笔者目前正在开发一种使用间充质干细胞的sEVs治疗肝硬化的方法。肝硬化由乙型肝炎和丙型肝炎等病毒、酒精以及西式的生活方式等引起的伴有炎症的肝损伤和后续纤维化形成。

在日本，肝硬化是一种国民性疾病，约有40万患者。然而，目前改善纤维化的药物仍存在尚未满足的医疗需求（unmet medical needs）^2）。笔者曾发表过间充质干细胞通过巨噬细胞改善肝硬化纤维化的研究（Stem Cells Transl Med, 2019)^3），间充质干细胞的主要作用机制来源于其sEVs的研究（NPJ Regen Med, 2021)^4），间充质干细胞的sEVs被肝脏受损区域的巨噬细胞高比例摄入，这些巨噬细胞发挥组织修复功能的研究（Inflamm Regen，2023 年）^5）。除笔者的报告外，还有其他报告指出，间充质干细胞的sEVs经静脉给药后，早期会聚集在肝脏和肺部，并且更易在巨噬细胞中聚集^6），因此，对于使用肝脏的巨噬细胞作为靶标的笔者而言，间充质干细胞的sEVs是非常具有吸引力的治疗剂。此外，笔者也证明了间充质干细胞受到interferon-γ（IFN-γ）刺激后产生的sEVs具有更好的治疗效果。

在不断积累基础研究的情况下，逐渐探索临床实践的路径。近年，日本再生医疗学会”外泌体制备与治疗相关工作组（主席：大阪大学纪之冈正博教授）指出开发高可信度治疗方法的重要性（Regenerative Therapy 2022)⁷⁾，Pharmaceutical and Medical Devices Agency （PMDA）的专家委员会也发布了使用外泌体等细胞外囊泡（EV）的治疗制剂的相关报告，从International Society for Extracellular Vesicles （ISEV）和各国公布的信息中也可以逐渐清晰sEVs治疗法开发的方向。

以间充质干细胞的sEVs治疗为目标，不仅需要与基础的间充质干细胞具有相同性和同一性，还需要大量培养技术、提取技术以及获得的sEVs具有相同性和同一性，并且有还需对in vivo与in vitro的效果及差异进行评估。此外，如何标准化sEV也是一个重要的课题，因为sEVs的质量和治疗效果参差不齐，而这种研究建立在稳定且频繁地验证和评估的基础上。下文将举例进行详细说明。

例如，评估sEVs中含有哪些蛋白和miRNA时，为了进行正确地评估，在准确提取sEVs的同时，必须将杂质降至最低。笔者因超速离心法等传统方法缺乏准确性时，发现了FUJIFILM Wako的MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2。使用这种方法，可尽量降低杂质含量，准确评估蛋白组学分析中的蛋白和miRNA分析中的miRNA，数据可信度高。最近，随着间充质干细胞增殖培养用培养基、sEVs回收用培养基、以及外泌体等细胞外囊泡的大规模纯化用分离柱的不断开发以及实际应用，笔者明显感受到在这些技术在进步的同时，sEVs治疗法的开发也在不断发展。

图1. 间充质干细胞临床研究的主要流程和MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2的应用步骤

◆血清sEVs中发现的肝纤维化标志物

在开发使用间充质干细胞sEVs的治疗法时，还从血清sEVs中发现了与肝硬化纤维化相关的生物标志物。在发现这一生物标志物及后续对多个样品进行验证时，FUJIFILM Wako的技术提供了很大地帮助。分析流程为，首先从肝硬化患者和健康人的血清中提取sEVs，然后进行蛋白组学分析，根据患者和健康人的sEVs表达蛋白的差异选择候选蛋白。为了检测选择的蛋白能否通过ELISA法定量检测，需从实际表达靶蛋白的cell line中提取sEVs，并使用靶蛋白的抗体进行检测。经验证后，使用定量且高可信度的抗体对多个样品的血清进行ELISA检测，并对照临床数据进行评估。在此过程中，使用上述从从血清中提取sEVs的MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2，可以准确地回收sEVs并可有效用于蛋白组学分析。此外，PS Capture™ Exosome ELISA Kit对于ELISA法也十分有效。通过使用试剂盒配套的CD63抗体识别sEVs，可以准确地定量评估血清中sEVs量。不仅如此，使用CD63抗体替换靶蛋白抗体，还可以准确评估表达靶蛋白的sEVs量，这对于当时发现靶蛋白却难以进行定量评估的笔者而言非常有用。并且，作为一名研究人员，笔者很高兴能在FUJIFILM Wako试剂盒的帮助下，发现了Lysyl oxidase⁸⁾ 相关的新型肝纤维化标志物Fibulin-4。这个系统一旦建立，就可以用于更多疾病标志物的发现和评估。此外，笔者还想借此机会感谢FUJIFILM Wako的今若直子老师、请川亮老师、西部隆宏老师在开发过程中提供的建议和支持。

图2. 从血清中开发生物标志物及MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2和PS Capture™ Exosome ELISA Kit的使用步骤

◆结语

本文介绍了sEVs生物标志物的开发，治疗开发的一部分以及与FUJIFILM Wako产品间的关系。其中，sEVs难以被看见，如果没有本次介绍的产品，无法在收集和分析高纯度的sEVs方面取得进展。参考FUJIFILM Wako官网网页介绍可以了解到外泌体研究的过程和产品阵容，包括用于生产、提取、定量和分析 等各类应用场景的sEVs 产品，毫不恭维地说，FUJIFILM Wako为我们提供了大量且高质量的产品，深刻感受到了该公司传递的热情。笔者衷心祝愿日本能涌现出更多这样的高新技术，推动标志物和治疗开发的发展。

参考文献

1）Kalluri, R. and LeBleu, V. S. : Science, 367（6478）, eaau6977 （2020）.

2）Tsuchiya, A. et al. : Inflamm. Regen., 39, 18 （2019）.

3）Watanabe, Y. et al. : Stem Cells Transl. Med., 8 （3）, 271 （2019）.

4）Takeuchi, S. et al. : NPJ Regen. Med., 6 （1）, 19 （2021）.

5）Takeda, N. et al. : Inflamm. Regen., 243 （1）, 48 （2023）.

6）Kang, M. et al. : J. Extracell. Vesicles, 10 （8）, e12085 （2021）.

7）Tsuchiya, A. et al. : Regen. Ther., 21, 19 （2022）.

8）Chen, W. et al. : Hepatology, 72 （2）, 729 （2020）.

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