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脑类器官和神经类器官

脑类器官和神经类器官不仅仅是由ES 细胞或 iPS 细胞诱导分化的单一细胞，而是作为由多种细胞组成的三维组织，局部再现了大脑组织和神经组织的结构与特征。随着人脑形成过程能够在in vitro进行观察，进一步推进了胎儿期神经发育以及疾病特有的信号异常等病理机制的研究。

本文介绍了脑类器官和神经类器官的背景介绍、制备原理、分化诱导实验方案、以及相关使用试剂。

◆脑类器官的背景介绍

人的脑结构非常复杂，且各个区域都具有其独特的功能。近年来，随着干细胞技术的发展，实现了模拟各个脑区特征的“脑区特异性类器官”的制备，从而推动了人脑发育机制的阐明、难治性精神疾病和神经系统疾病病理机制的阐明，以及创新药物的研发。

大脑类器官

大脑占据全脑一半以上的体积，被认为是主导知觉、思维、语言、注意力、情景记忆和随意运动等复杂生命活动的核心调控中枢。大脑类器官有望广泛用于研究人脑发育过程中尚未充分阐明的机制，尤其是研究人类进化过程中发生显著物种特异性扩张和多样化的细胞群体。例如，上皮质层外侧放射状胶质细胞（outer radial glia，oRG）和胼胝体投射神经元（callosal projection neurons，CPN）等人皮质细胞的多样化过程。

in vivo 中大脑皮层的发育与结构

大脑皮层经过以下发育过程形成。

● 早期增殖期（神经上皮的增殖）

神经管闭合后，神经上皮细胞（Neural Epithelial Cell，NEC）通过对称分裂持续进行自我复制，使神经上皮细胞储备不断增殖。

● 神经发育（神经元的生成）

随着神经发育开始，神经上皮细胞（NEC）逐渐分化为放射状胶质细胞（Radial Glial Cell，RGC）。神经元胞体位于脑室侧，并将突起伸向脑

表面的软脑膜侧（basal side）的 RGC，这类RGC被特别称为顶端放射状胶质细胞（apical Radial Glial Cell，aRGC）。aRGC 通过不对称分

裂，产生一个 aRGC，以及一个中间祖细胞（Intermediate Progenitor Cell，IPC）或一个神经元。

● 六层结构形成

由 aRGC 产生的神经元从深层（第 V/VI 层）向上层（第 II/III/IV 层）逐步迁移排列，构建出大脑皮质特征性的的分层六层结构。

● 边缘带（MZ）的调控

起源于大脑皮层原基以外区域的 Cajal–Retzius细胞沿切线方向迁移，形成边缘带（Marginal Zone，MZ），并调控神经元在各皮质层的正确分

层排列。

大脑皮层的种间差异

人大脑皮层的神经细胞数量约160亿个，约为小鼠的1,000 倍，即使与人类亲缘关系最近的黑猩猩（约 60 亿个）相比，也约为其的 2.7 倍，规模十分庞大。神经细胞的数量直接受到早期发育阶段神经上皮细胞（Neuroepithelial cell，NEC）细胞储备规模的影响。NEC 的增殖周期越长，最终形成的神经细胞数量就越多。研究证实，与啮齿类动物相比，灵长类动物的 NEC 增殖周期确实更长。

人大脑皮质的显著特征之一，是位于第 II/III 层（皮质上层）的锥体神经元比例显著增加。小鼠皮质上层神经元由 3 个亚型组成，而人类存在 5 个亚型。由于大脑皮质的每一层都具有特定的功能，因此，这些上层神经元的多样性（即获得多种亚型）被认为是支撑人类特有的高级认知功能以及大脑高功能进化的基础。

另一个关键物种差异在于大脑皮质是否具有褶皱结构（脑回），该结构能够使人类在有限的颅腔容积内扩大大脑皮质的表面积。外侧脑室下区（Outer Subventricular Zone，oSVZ）和基底放射状胶质细胞（Basal Radial Glia Cells，bRGC）在人类等具有脑回结构的哺乳动物中大量分布，而在小鼠中几乎不存在。由此推测，bRGC 是参与皮质扩张和折叠的重要神经前体细胞来源，在人类脑回和脑沟的形成过程中发挥重要作用。

大脑皮质类器官诱导实验方案

使用人多能性干细胞（hESC/hiPSC）诱导大脑皮质类器官的方法，根据不同技术路径，可分为“Pre-patterning”和“Self-patterning”两类。

① Pre-patterning (定向诱导法)

这是一种通过从外部添加外源性信号（小分子化合物或生长因子），将细胞定向诱导分化为目标脑区的方法。过去从小鼠ES细胞进行神经分化诱导常使用在添加血清条件下形成拟胚体（Embryoid Body，EB）的方法，但问题在于其分化效率低。为此，笹井、渡边等人开发了采用无血清培养基的悬浮培养方法——“SFEB 法”，成功诱导了在端脑、脑室带、脑室下带及中间层特异性表达的转录因子“Foxg1”，并证实该体系可稳定获得端脑前体细胞。此外，通过在培养系统中添加ROCK抑制剂可大幅改善细胞存活率，该方案最终在人细胞中成功再现。

然而，SFEB 法形成的细胞块大小不一，Foxg1阳性细胞的诱导效率低于50%，因此其重复性问题仍待解决。永樂等人开发的“SFEBq 法”解决了这一问题，他们利用低吸附 96 孔板，使细胞快速强制聚集，成功制备出大小均一的细胞团块。可将Foxg1 的表达效率最高提升至75%。

② Self-patterning（自发性非定向诱导法）

这是一种不依赖外源性模式化因子，最大限度利用干细胞原有的自组织（Self-organization）能力的方法。

Lancaster 等人建立的实验方案是不使用外源性信号因子，而是依托并强化干细胞内在分化能力（Self-patterning）的方法。该方法不依赖化合物进行定向调控，而是将胚状体（EB）包埋于 Matrigel 液滴中，使用旋转式生物反应器进行旋转培养，以促进营养吸收和细胞的三维生长。在该培养系统中，可形成围绕脑室样腔体、具备N-cadherin顶端极性的神经上皮层。这个方法能够实现10个月以上的长期培养，除大脑皮质组织外，还可同时形成类似脉络丛和视网膜的结构。培养早期可检测到前脑、中脑和后脑标志物的表达，但随着培养时间延长，前脑标志物的表达水平维持在高水平。尽管未通过外源性因子进行模式化，但最终仍可检测到前脑标志物Foxg1和皮质标志物Emx1的表达。此外，在组织内部还观察到了脑室区、脑室下区和皮质板类似的层状结构，以及灵长类特异性神经干细胞中bRGC样结构和标志物的表达。

中脑类器官

中脑是由参与视觉、感觉、认知功能和运动控制的神经核团、神经纤维及神经通路组成的复杂脑区。尤其是位于中脑导水管腹侧的多巴胺核团，广泛分布于腹侧被盖区（Ventral Tegmental Area，VTA）和整个黑质，在奖赏、认知及随意运动控制中发挥重要作用。由于中脑多巴胺（midbrain dopamine，mDA）系统功能障碍与帕金森病（Parkinson disease，PD）、注意缺陷多动障碍、自闭症、药物依赖以及儿童神经系统疾病等多种神经系统和神经精神疾病相关，因此，中脑类器官可作为再现上述疾病的空间以及分子特征的重要且有效的研究模型。

小脑类器官

除参与运动行为外，小脑近年来在语言、空间认知、工作记忆和情绪处理等认知功能方面的功能也备受关注。小脑的发育异常与 Dandy–Walker 畸形、小脑蚓部发育不全及髓母细胞瘤的发生密切相关，为阐明这些疾病的病理机制，并推动药物研发和治疗策略，目前正在积极开展hPSC来源小脑类器官的研究。

下丘脑类器官

下丘脑负责维持机体稳态（体温、昼夜节律、进食和生殖），与垂体协同调节激素分泌，在连接神经系统与内分泌系统中发挥重要作用。其功能障碍不仅会导致代谢性疾病（肥胖、糖尿病、尿崩症）和睡眠障碍，还与阿尔茨海默病、帕金森病（PD）等神经退行性疾病密切相关。近年来，用于制备影响下丘脑的上述疾病模型的hPSC来源类器官研究备受关注。

纹状体类器官

纹状体在连接人脑内神经回路方面发挥重要作用，其功能障碍可导致亨廷顿病（Huntington’s disease，HD）等神经系统疾病。纹状体类器官可用于研究纹状体的发育及相关疾病、评估不同脑区之间神经回路的特性，以及验证治疗策略，是该领域极具实用价值的研究模型。

◆脑类器官制备实验方案

下面将系统介绍大脑皮质类器官、中脑类器官、小脑类器官、下丘脑类器官和纹状体类器官的制备实验方案及使用的试剂。

大脑皮质类器官制备实验方案和使用试剂

以下是大脑皮质类器官制备过程中各步骤使用的试剂。实验方案的详细信息，请参阅参考文献（Supakul, S., et al., 2023）。

※ 基于Supakul, S., et al., 2023 的研究数据修改与编制

中脑类器官制备实验方案和使用试剂

以下是中脑类器官制备过程中各步骤使用的试剂。有关实验方案的详细信息，请参阅参考文献（X, Yao et al., 2023）。

※ 基于X, Yao et al., 2023的研究数据修改与编制

小脑类器官制备实验方案和使用试剂

以下是小脑类器官制备过程中各步骤使用的试剂。有关实验方案的详细信息，请参阅参考文献（Atamian, A., et al., 2024）。

※ 基于Atamian, A., et al., 2024的研究数据修改与编制

下丘脑类器官制备实验方案和使用试剂

以下是下丘脑类器官制备过程中各步骤使用的试剂。有关实验方案的详细信息，请参阅参考文献（Sarrafha, L., et al., 2023）。

※ 基于Sarrafha, L., et al., 2023的研究数据修改与编制

纹状体类器官制备实验方案和使用试剂

以下是纹状体类器官制备过程中各步骤使用的试剂。有关实验方案的详细信息，请参阅参考文献（X, Chen et al., 2022）。

※ 基于X, Chen et al., 2022的研究数据修改与编制

◆神经类器官的基础

人干细胞来源神经元不仅是药物研发和重大神经系统疾病治疗方法开发的重要基础，也被广泛用于神经发育、神经功能及疾病机制阐明的研究。近年的研究表明，在生理学建模中，适宜的多细胞组织及其微环境至关重要。因此，作为能够更准确再现多细胞结构的系统，in vitro 3D“类器官”培养系统的应用日益广泛。

区域化类器官

区域化类器官是指在使用多能干细胞（如iPS 细胞等）三维构建器官或组织时，通过模拟体内的发育过程，在单个类器官内部生成具有特定功能和结构区域（模式化）的组织构建技术及其产物。

区域化类器官示例

除上述介绍的类器官外，还报道了以下多种类器官的制备方法。

① 脉络丛（Choroid Plexus）类器官

脉络丛类器官起源于背内侧端脑区域最背侧的盖板（Roof plate）。在发育过程中，会在高表达 BMP 和 Wnt 信号的区域中形成。以大脑皮质类器官的诱导条件为基础，在神经区域化完成后的培养第18天起，持续添加Canonical Wnt 信号通路激活剂（CHIR99021）和BMP4蛋白。由此，可在三维条件下高效诱导形成 LMX1A/OTX2/转甲状腺素蛋白阳性的脉络丛上皮组织。

② 海马体（Hippocampus）类器官

海马体起源于端脑内侧的内侧皮质，位于大脑皮质与脉络丛之间。

与脉络丛的诱导相同，使用CHIR99021和BMP4，但将添加时间限定为培养第18～21 天，共 3 天。由此可定向诱导形成背内侧端脑。经过长期培养（60天以上），可观察到海马标志物（ZBTB20）和齿状回神经元标志物（PROX1）的表达。

③ 脊髓（Spinal Cord）类器官

在脊髓发育过程中，由组织中心分泌的因子形成浓度梯度（背侧为 BMP/Wnt 信号，腹侧为 Shh 信号等），使脊髓背侧分化为6个前体细胞区域，腹侧分化为5个前体细胞区域。

在传统运动神经元诱导实验方案中，通过去除 BMP 抑制剂（LDN-193189）和 Shh 激动剂（SAG），可更广泛地诱导背侧至中间区域的连续神经上皮。随后，通过按浓度梯度添加外源性SAG，可灵活调控其向脊髓中间区域或腹侧区域进行模式化分化。

④ 腹侧端脑（Ventral Telencephalon）类器官

该区域主要产生抑制性中间神经元，由外侧基底核原基（lateral ganglionic eminence，LGE）、内侧基底核原基（medial ganglionic eminence，MGE）和尾侧基底核原基（caudal ganglionic eminence，CGE）等亚结构组成。

在 Shh信号的作用下，分别模式化为 LGE（GSH2阳性）、MGE（NKX2.1阳性）和 CGE（COUP-TFII阳性）。在大脑皮质分化培养的第15～21天期间，添加低浓度（30 nM）的 SAG 后，可在连续的上皮组织中形成 PAX6（大脑皮层）和 GSH2（LGE）阳性区域。另一方面，添加高浓度（500 nM）的 SAG 可抑制PAX6 和 GSH2 的表达，高效诱导 NKX2.1 阳性的神经上皮，实现完全腹侧化。