小鼠生殖工程学技术——6体外受精

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◆材料

1. 生理盐水生理盐水（大塚制药 日本药典 大塚生注食）

2. PMSG（asuka制药 注射血清促性腺激素 动物用性腺激素1000单位/管）

3. hCG（asuka制药 注射用胎盘促性腺激素，动物用性腺激素3000单位/管）

4. 1 mL注射器（泰尔茂株式会社SS-01T2613S）

5. FERTIUP^® 精子预孵培养基（Cosmo Bio Co., Ltd）

6. CARD MEDIUM^®（Cosmo Bio Co., Ltd）

7. mTHF（Cosmo Bio Co., Ltd）

8. 电动移液器（法国吉尔森电动单道移液器P-200　P-20）

9. 黄色枪头  （BM医疗器 Cat.No.110-96R）

10. 受精用的枪头（Quality Scientific Plastics Pipet Tip Cat.No.114）

11. 流动石蜡（Nacalai Tesque Cat.No.26137-85）

12. 培养皿（Corning  35mm X 10mm　Cat.No.430588）

13. 解剖用大剪刀  （夏目制造所 反剪刀 Cat.No.B-2）

14. 解剖用小剪刀  （夏目制造所  小直剪刀Cat.No.B-12）

15. 解剖用大钳子（夏目制造所  无钩尖细的镊子    Cat.No.A-5）

16. 解剖用小钳子 （夏目制造所 尖镊子  Cat.No.A-45）

17. noesu剪刀（森田制造所  电话03-3811-9730 特别订制品）

18. 解剖针（夏目制造所 Broach holderCat.No.E-14）

19. 滤纸

20. 微管

22. 倒置显微镜

23. CO₂培养箱

◆方法

过量排卵处理

1. 把激素（PMSG 和hCG） 溶于37单位/mL的生理盐水中

1. * 激素溶液在4°C下，可保存2周

2. 成年雄性小鼠（8~12周龄）需腹腔注射2次，第一次注射PMSG0.2 mL（7.5単位）/只，48小时后，第二次注射hCG 0.2 mL（7.5单位）/只，然后进行过量排卵处理。（通常最好在下午5~6点期间注射激素）

滴液准备

1. 按以下步骤，制作滴液（a、b、c），并静置在二氧化碳培养箱里，令气流稳定。

a 在解冻精子前30分钟，制作个精子孵育用的培养皿（100 μL FERTIUP^® 精子预孵培养基液滴），准备静置在培养箱里；

b 取卵前10分钟，制作受精用培养皿（200 µLCARD MEDIUM滴液1个），静置在培养箱里体外受精时，根据所用精子的不同有不一样的调试方法，详情请参考产品说明书。

C 制作清洗卵子用的培养皿（80 µLmHTF滴液4个），在培养箱里静置30中以上

采集精子

用酒精消毒所有的解剖器具

1. 让1~2只成年雄性小鼠（3~6个月龄）安乐死，用大剪刀和大钳子取出附睾管、附睾及一部分脂肪，在滤纸上切除附睾尾及去除血液和脂肪；

2. 把切除的的附睾尾放入精子预孵用培养皿的流动石蜡中；

3. 用小镊子固定附睾尾，用noesu剪刀切开尾部中央的附睾管；

4. 用解剖针在附睾尾轻压，从附睾管的切开位挤压出精子块；

5. 迅速用解剖针挑出精子块，然后放进FERTIUP^® 的精子预孵培养基的滴液里；

   ＊在精子预孵培养皿的滴液里，如精子黏在解剖针的尖端，可用另一根解剖针轻柔地把精子剥离；

6. 把精子注射入FERTIUP^® 精子预孵培养基里，放进CO₂培养箱里（37°C 5% 二氧化碳 95% 空气）培养60分钟。

采集卵子

用酒精消毒所有的解剖器具

1. 让进行了过量排卵处理的雌性小鼠在注射了hCG的15~17个小时后安乐死，取出小鼠的子宫、输卵管、卵巢、及一部

1. 分脂肪，然后在滤纸上切除输卵管的尾部及 去除血液和脂肪；

2. 把输卵管浸入受精用培养皿的流动石蜡中；

3. 用镊子把输卵管固定到培养皿底部，用解剖针撕破输卵管壁的胀大部分，把流出的卵子放入CARD MEDIUM 的滴液中。

取出的输卵管放置在室温下3分钟以上，卵子的受精能力及生殖能力就会显著下降，因此从雌性小鼠安乐死后到将输卵管取出，再把卵子放入受精用的CARD MEDIUM滴液这一过程要在极短时间内完成（30秒内）。

 一个人实验的情况下，请不要一次性安乐死数只雌性小鼠，应该一只只进行，并迅速采集卵子。

 一滴CARD MEDIUM里，请引入一只雌性小鼠（两颗）的卵子。

4. 采集卵子后，把受精用培养皿静置在CO₂培养箱里进行30~60分钟的培养。

受精

1. 用受精用枪头（Quality Scientific Plastics Pipet Tip  Cat.No.114），吸取约6µL预孵的精子悬浊液，然后注射进含有卵子的受精用培养皿的CARD MEDIUM滴液里（进行受精）；

2. 将受精用培养皿放在CO₂培养箱里进行培养；

3. 受精3小时后，用玻璃微管吸取形态正常卵子，注射到新的清洗卵子用培养皿的mHTF滴液里，按照（a→b→c）顺序进行洗涤；

＊ 清洗时，要非常注意在清洗卵子培养皿的滴液上不能混有CARD MEDIUM^®

＊ 清洗前，卵子的透明带表面附着许多精子，使用装有黄色枪头的电动移液器（20μL），在受精用的培养皿的CARD MEDIUM^®滴液里移液20~30次后，再清洗卵子。

4. 受精6个小时后，仔细观察卵子，去取单性生殖卵（卵子细胞内只有1个原核），培养至次日。

正常受精卵可见第二极体和雌雄原核（见左图），单性生殖卵里只有一个原核（见右图），未受精卵无法看到原核（见右图）

5. 次日（受精24~28小时后），次日，只把发育到2细胞期的胚胎移到清洗卵子用的培养皿内留下的滴液里，数完胚胎数后，就能将其用于移植或者冻存。

2细胞期胚胎直到囊胚期前都能在体外进行培养 ，在培养时要使用KSOM/AA。

参考文献

  【1】 Takeo T., Nakagata N. 2015 Superovulation Using the Combined Administration of Inhibin Antiserum 

            and Equine Chorionic Gonadotropin Increases the Number of Ovulated Oocytes in C57BL/6 Female Mice. PLoS One. 

           2015 May 29;10(5):e0128330. doi: 10.1371/journal.pone.0128330.

更新说明

更新 2015.06.01

本实验与使用PMS/hCG进行体外受精的相比，有以下两个不同点。

第一点是在受精用培养皿的CARD MEDIUM滴液中放进两颗未受精卵子；第二点是需要6µL受精用的精子悬浊液。

更新 2015.09.03

注射CARD过量排卵诱导剂的小鼠日龄从24~28日改成25~29日。

注射量由0.2mL改成0.1mL~0.2mL。

更新2015.11.18

把CARD过量排卵诱导剂改写成CARD HyperOva™

用C57BL/6J小鼠进行实验时，发现26~30日龄的小鼠实验效果良好，特此更改注射期。