小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

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◆材料

1、  过量排卵处理后的雌性小鼠
2、  FERTIUP^®精子预孵培养基（Cosmo Bio Co., Ltd）
3、  CARD MEDIUM^®（Cosmo Bio Co., Ltd）
4、  mHTF（Cosmo Bio Co., Ltd）
5、  枪头（Pipette Tip Cat.No.114 Quality Scientific Plastics）
6、  培养皿（Corning 35mm×10mm Cat.No.430588）
7、  与吸管配用的注射器
8、  恒温水箱（37°C）
9、  精子复苏用的Float
10、自动移液器（GILSON PIPETMAN P-200 P-1000）
11、CO₂培养箱
12、剪刀
13、吸水纸

◆方法

制作复苏精子的漂浮装置

1、50mL的离心管与泡沫组合成漂浮装置如下图，用于精子复苏。

复苏精子前的准备

1、  准备恒温水箱（37°C）
2、  用37°C的温水装满装置里的离心管后，放进水箱里，漂浮装置就会浮起来，如下图

3、  在复苏精子前30分钟，制作精子预孵培养皿（滴入90μL FERTIUP^® 精子预孵培养基），准备静置在培养箱里。

4、  收集卵子的前10分钟，制作受精用的培养皿（滴入一个90μL CARD MEDIUM^® 滴液，静置在培养箱。

※根据体外受精用的精子的不同，CARD MEDIUM^® 调试方法也不同。具体请参考操作说明书。

5、  制作清洗卵子用的培养皿（80µL mHTF滴液4个），在培养箱里静置30分钟以上。

采集卵子

1、 让进行了过量排卵处理的雌性小鼠在注射了hCG 的15~17个小时后安乐死，然后把卵子放进受精用的培养皿的CARD MEDIUM^® 滴液里（一滴液里可放2~3只小鼠的卵子）

※ 从雌性小鼠安乐死后到将输卵管取出，再把卵子放入受精用的CARD MEDIUM^® 滴液这一过程要在极短时间内完成（30秒内）

※一个人实验的情况下，请不要一次性安乐死数只雌性小鼠，应该一只只地进行，并迅速提取卵子。
2、采集卵子后，把受精用培养皿放进 CO₂培养箱里预孵培养30~60分钟。

精子的复苏

1、用钳子取出液氮储存器里的吸管，在空气中逗留5秒，立刻放置37°C恒温水箱的装置里，进行加热。

要点：为确保在37°C下加热，将吸管里的冻存精子朝下方放进浮动物里。

要点：冻融的精子会因处在的周围环境的变化而变弱，在精子运动前，从高粘性精子保存液里移至低粘性培养基（FERTIUP^® 精子预孵培养基），复苏后的精子的运动能力不会完全恢复。为了能让复苏后的精子在37°C加热5分钟以上精子就能很好地运动，请让试管在37°C温水中静置10分钟后，将精子悬浊液移至预孵培养基中(FERTIUP^®精子预孵培养基)。
2、 加热后，从37°C恒温水箱里取出试管，用吸水纸把试管表面的水分吸干。

取出精子悬浊液进行预孵

1、 切断吸管内的mHTF与封口的中间处（要提前拉出注射器的内筒）

2、 把剪断后的吸管插入到注射器里。

3、 吸管插入注射器后，吸管内气压变高，为了释放气压，需要转动一次三路活塞的一个旋塞。

4、旋塞往上回正后，切断精子悬浊液与封口中间处。

5、慢慢按下注射器内筒，只把精子悬浊液注射进精子预孵培养皿的滴液中。

6、  往培养箱内放入5个精子预孵培养皿，培养30分钟。

要点：精子预孵培养皿需要静置在培养箱里直到精子已完全复苏。请注意不要在精子完全复苏前摇动培养皿，否则精子的运动性能就不能完全得到恢复。

受精

1、 用枪头（Pipette Tip Cat.No.114 Quality Scientific Plastics），吸取预孵后的精子悬浊液10μl，注射进含有卵子的受精培养皿的CARD MEDIUM^® 滴液里。（受精）
2、 受精后，把受精用的培养皿放进培养箱里进行3小时培养。

要点：受精用的精子悬浊液是从集合优良精子的预孵培养液滴液的边缘里收集。（请参阅下图

要点：一个滴液里可收集3~4次精子悬浊液。

要点：精子悬浊液要注射进受精用培养皿的滴液里，使卵子充分接触精子悬浊液。

3、 受精后3小时 ，在清洗卵子用培养皿的滴液清洗正常形态的卵子，培养至次日。

※清洗前，由于卵子的透明带上会附着许多精子，所以用装上枪头的自动移液器，把受精用培养皿的CARD MEDIUM^® 滴液移液20~30次后，才清洗卵子。

※清洗的时候，请注意，尽量不要把CARD MEDIUM^® 带入到清洗卵子用培养皿的滴液里。

4、 受精6个小时后，仔细观察卵子，摘取单性生殖卵（卵子细胞内只有1个原核），培养至次日。
5、 次日，只把发育到2细胞期的胚胎移到清洗卵子用的培养皿内留下的滴液里，数完胚胎数后，就能将其用于移植或者冻存。