小鼠生殖工程学技术——4取出低温运输的小鼠附睾尾部

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◆材料

1、用CARD冷藏运输试剂盒运输的小鼠附睾尾
2、FERTIUP^® 精子预孵培养基（Cosmo Bio Co., Ltd）
3、mHTF
4、电动移液器（GILSON PIPETMAN P-200）
5、黄色枪头（BM机器 Cat.No.110-96R）
6、流动石蜡（nacalai Cat.No.26137-85）
7、培养皿（Corning 35mm×10mm Cat.No.430588）
8、解剖用的剪刀（夏目制造所 小直剪刀 Cat.No.B-12）
9、解剖用的钳子（夏目制造所 尖钳子 Cat.No.A-45）
10、滤纸
11、CO₂ 培养箱

◆方法

1、 取出附睾尾的前30分钟，制作精子预孵用培养皿（一个100μL FERTIUP^® 精子预孵培养基滴液），静置在培养箱里。

2、 从泡沫箱里取出保温瓶，再从保温瓶内的纸盒里取出装有附睾尾的0.2mL EP管。
3、 打开0.2mL EP管的盖子，取出附睾尾放在滤纸上，擦干附睾尾表面的冻存液。

※用剪刀和钳子来除去附睾尾上留有多余的脂肪、组织、血液。

4、 在清洗用培养皿的mHTF滴液内清洗3次附睾尾，用滤纸擦干附睾尾上mHTF。
※清洗用培养皿（3个大约100μL 的mHTF滴液），取出的附睾尾直接在此清洗。

5、 把附睾尾浸泡在精子预孵用培养皿的流动石蜡里。

6、 在附睾尾部采集精子，供体外受精用，采集的精子进行体外受精的步骤与用新鲜精子受精的步骤相同。

要点：在附睾尾的切口处采集精子时，如果精子难以露出，就往切口处再切深点，尽量采集更多的精子。

注意：用冷藏精子的受精培养基（CARD MEDIUM^®)的调试方法与用新鲜精子受精的方法有差异，请详细阅读受精培养基的使用说明，准备受精用培养皿。