小鼠生殖工程学技术——9CARD以外的方法冻存的精子进行体外受精

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◆材料

1、 用CARD以外的方法来冻存精子（冻存管或者吸管）
2、 过量排卵处理后的雌性小鼠
3、FERTIUP^®精子孵育培养基（Cosmo Bio Co., Ltd）
4、CARD MEDIUM^®（Cosmo Bio Co., Ltd）
5、mHTF
6、 恒温水箱（37°C）
7、 复苏精子用的漂浮装置
8、 剪刀
9、 吸水纸
10、1.5 mL  EP管（微型离心管）（Quality Scientific Plastics 1.5ml Graduated Microcentrifuge Tube with Flat Top Cap, Natural Cat.No. 509-GRD-Q）
11、离心分离机
12、电动移液器（GILSON PIPETMAN P-200 P-1000）
13、培养皿（Corning 35mm X 10mm Cat.No.430588）
14、流动石蜡（nacalai Cat.No.26137-85）
15、CO2培养箱

◆方法

制作复苏精子的漂浮装置

1、50ml的离心管与泡沫组合成漂浮装置如下图，用于精子复苏。
 

复苏精子前的准备

1、准备恒温水箱（37°C）
2、用37°C的温水装满漂浮装置的离心管后，放进水箱里，装置就会上浮，如下图

3、在复苏精子前30分钟，制作精子预孵培养皿（100μl FERTIUP^® 精子预孵培养基滴液），静置在培养箱里。

4、采集卵子前10分钟，制作一个采集卵子用的培养皿（200μL的CARD MEDIUM^®滴液），静置在培养箱里。

※根据体外受精用的精子的不同，CARD MEDIUM^®调试方法也不同。具体请参考操作说明书。

5、制作清洗卵子用的培养皿（80µLmHTF滴液4个），在培养箱里静置30分钟以上。

未受精卵的采集和培养

1、让进行了过量排卵处理的雌性小鼠在注射了hCG 的15~17个小时后安乐死，然后把卵子块放进采集卵子用的培养皿的CARD MEDIUM^®滴液里（一滴液里可放3~10只雌性小鼠的卵子块）。

※ 从雌性小鼠安乐死后到将输卵管取出，再把卵子放入受精用的CARD MEDIUM^®滴液这一过程要在极短时间内完成（30秒内）。

※一个人实验的情况下，请不要一次性安乐死数只雌性小鼠，应该一只只地进行，并迅速采集卵子。
2、未受精卵在采集卵子培养皿里预孵培养60分钟。
 

解冻精子

1、从液氮储存器中取出样品（放有冻结精子的试管或吸管），迅速放置37°C恒温水箱里。
精子在冻存管的情况下，要迅速打开管盖，倒掉管内的液氮，然后浸泡在恒温水箱内。精子在吸管的情况下，要迅速将吸管放置恒温水箱的漂浮装置里。

2、把样品内的所有精子悬浊液移置到1.5ml的EP管内，慢慢加入37°C的mHTF （1.2mL），轻轻搅拌后进行离心（300g 5分钟 室温）；

3、去除澄清层（mHTF 里含有约30μL的颗粒会沉淀在试管底部）。然后加入37°C的FERTIUP®精子预孵培养基70μL，轻轻摇匀）

4、用枪头吸取EP管内的全部液体，注射进精子预孵培养皿的滴液里，进行30分钟的预孵培养。
 

受精

1、用枪头吸取预孵后的未受精卵时，尽量少吸入培养液，然后把未受精卵注射到含有复苏精子的精子预孵培养皿的滴里，进行受精。

2、受精3小时后，在清洗卵子培养皿的mHTF滴液里清洗正常形态的卵子，培养至次日。

3、受精6个小时后，仔细观察卵子，去取单性生殖卵（卵子细胞内只有1个原核），其余卵子培养至次日。
4、次日，只把发育到2细胞期的胚胎移到清洗卵子用的培养皿内留下的滴液里，数完胚胎数后，就能将其用于移植或者冻存。

参考文献

   [1]   Nakagata N., Takeo T., Fukumoto K., Haruguchi Y., Kondo T., Takeshita Y., Nakamuta Y., Umeno T., and Tsuchiyama 

          S. 2014. Rescue In VitroFertilization Method for Legacy Stock of Frozen Mouse Sperm. J Reprod Dev. 60(2): 168-171