小鼠生殖工程学技术——7冻存小鼠胚胎

便捷的玻璃化冷冻保存小鼠胚胎

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◆材料

1. 　1M DMSO (Cat. CSR-R-T072)

2. 　DAP213 (Cat.# CSR-R-T073)

3.　培养皿 (35mm X 10mm Cat.No.430588; CORNING)

4.　过滤装置(Millex-GV 0.22µm Cat.No.SLGV013SL; MILLIPORE)

5.　灌注凝胶枪头 (MBP Gel 200, Cat.No.3621; Molecular BioProducts)

6.　移液管

7.　冻存管(Cryogenic Vials Cat.No.MS-4501W; Sumitomo Bakelite, Japan is recommended. If you cannot get it, use 366656; NUNC.)

8.　微管

9.　冻存架

10.　Nalgene 冷却器 (5115-0012; NALGENE, USA)

11.　液氮

12.　显微镜.

13.　0.25 M 蔗糖

14.　KSOM/AA

15.　液体石蜡

◆步骤

冷却器和冻存管的准备

1. 　使用前一天，把冷却器放置-20°C 的冷藏库里。

2. 　在实践玻璃化步骤的前10分钟，从冷藏库里取出冷却器。

3. 　冻存管放入冷却器里 (5115-0012; NALGENE, USA)。
       一只冻存管能装大约40个胚胎，换而言之，当你想装120个胚胎时，你需要放3只冻存管在冷却器里。

4. 　开始实验之前，请检查冻存管内的温度是否为0°C 。

玻璃化

1. 　过滤1M DMSO后，在培养皿上滴入4个滴液（~100µL / 个）。其中一滴用于清洗从培养基里采集的胚胎，其余三个用于存放已清洗的胚胎。

2. 　把全部胚胎放入其中一个滴液里，清洗沾有培养基的胚胎。清洗后的胚胎平均放进其余的3个滴液里。这3个等份的胚胎最终将会转移至储存小瓶里。

例如，采集了120个胚胎，分成3个等份，每一等份40个，这些胚胎首先会一起放到清洗的滴液里，然后再分成3份放进3个滴液里。

3.　使用20µL移液管和灌注凝胶枪头 , 转移5µL 的1M DMSO溶液的胚胎至冻存管内。转移后，立即将冻存管放置0°C 冷却器内5分钟。

注意: 冻存管可以放在0°C 冷却器中超过5分钟 (<20分钟)。

       注意: 如果胚胎都集中在滴液的中央，就能把全部胚胎轻易地吸进5µL 的M DMSO 溶液中。

4.　在0°C 下，往冻存管里加入45µL 的冻存液(DAP213) ，并在在0°C冷却器里静置5分钟。 

注意: 加入 DAP213冻存液后，不要把低温管的塞子拧得太紧，否则胚胎复苏后很难快速转移。

5.　迅速将冻存管放到冻存架上，然后直接放进液氮里。

参考文献

【1】 Nakagata N. 1989. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. J. Reprod. Fert. 87: 479-483.

【2】 Nakagata N. 1993. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization between cryopreserved gametes. J. Reprod. Fert. 99: 77-80.

【3】 Nakagata N. 1995. Studies on cryopreservation of embryos and gametes in mice. Exp. Anim. 44: 1-8.

【4】 Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and effcient procedure for cryopreservation of mouse embryos by simple vitrification. Exp. Anim. 46: 231-234. 118.