小鼠生殖工程学技术——8胚胎移植入输卵管

在实验中，我们通过输卵管壁将2细胞期胚胎移植入代孕小鼠体内。与传统胚胎移植的过程相比，更简易，而且适合没有经验的实验操作员。

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◆材料

1.　假孕第一天的雌性小鼠(这天观察小鼠阴栓)

2.　微型弹簧剪刀（5mm刀片）

3.　钳子（Pair of watchmaker's #5 forceps）

4.　动脉夹

5.　伤口缝合器(Autoclip 9mm; Clay Adams 427631) 和clip applicator (Mik-Ron Autoclip Applier; Clay Adams 427630)

→clip applicator

6.　塑料培养皿 (35mm X 10mm Cat.No.430588; CORNING)

7.　用于胚胎的移植和操作的玻璃微管

◆步骤

准备小鼠

1.　麻醉一只雌性小鼠。

2.　常规方法是取出卵巢、输卵管及部分子宫。

3.　用动脉夹固定附着在卵巢囊上的脂肪

定位输卵管

如下图所示，通过切割输卵管，往切口处插入微管，然后朝输卵管的壶腹部注入胚胎。

但是，正如我们所看到的输卵管的图示(A)，小鼠的输卵管呈细微而复杂的折叠式结构。而且，微管是从上方插入的，胚胎难以到达输卵管的壶腹部。

为了简化此过程，在操作前，可以通过动脉夹来改变输卵管的定位，如图(B)。

1.   立体显微镜下观察输卵管，并使用钳子的尖端来确认输卵管伞部和壶腹部的位置，或者改变动脉夹的位置。

2. 　通过改变动脉夹和小鼠的位置来定位输卵管。

      注意：因为每只小鼠的输卵管折叠形状都不一样，需要仔细观察和定位输卵管才能更容易地进行实验。
      注意：如果你是左撇子，就能轻易地完成定位输卵管的步骤。

胚胎与玻璃微管的制备

１.   在培养皿上制作一个200μL的 KSOM/AA滴液 (无液体石蜡)，然后在滴液里放入20个胚胎。

2.   制作转移胚胎的玻璃微管，管内的空气和溶液交替间隔2-3mm 。然后用玻璃微管吸入10个胚胎。

     注意：如上图所示，当玻璃微管首次插入滴液时，液体石蜡会残留在滴液的表面。玻璃微管应从另一边吸入胚胎，以免吸入液体石蜡。

有证据表明，如果输卵管沾上液体石蜡会对胚胎发育造成不利的影响。 

转移胚胎

１.   使用Pair of watchmaker's #5 forceps和微型弹簧剪刀，解剖伞部和壶腹部之间的输卵管壁。

2.　将含有胚胎的微管插入输卵管的切口处，朝壶腹部注入胚胎。

3. 　用钳子固定微管插入的输卵管的位置。

4. 　排出胚胎和2~3个气泡到壶腹部处。

注意： 如果实验进程顺利，你可以通过壶腹部的壁看到气泡。

　　注意：如果你无法将胚胎和气泡排进输卵管，稍微往后移动玻璃微管，再次尝试。 

5.　将切口处的微管移走。

注意：调整输卵管的位置和方向后才能转移胚胎。如果微管平行对齐输卵管，就能更容易地插入输卵管内。 

6.　把卵巢、输卵管和子宫放回小鼠的腹部，用伤口缝合器缝合伤口。 

7.　重复上述步骤，把剩余的10个胚胎移植到另一只小鼠的输卵管内。

8.　在37°C 加热板上保持小鼠的体温，直到小鼠苏醒。

参考文献

【1】  Nakagata N. 1992. Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice. Exp. Anim. 41: 387-388.

【2】  Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., and Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual (Third edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-591-9.