小鼠生殖工程学技术——10复苏玻璃化冷冻后的胚胎的步骤

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◆材料

１、　0.25 M 蔗糖
２、　KSOM/AA
３、　培养皿（Corning　35mm X 10mm　Cat.No.430588）
４、　蓝色枪头（BM器材　Cat.No.111-R100S）
５、　微管
６、　自动移液器（GILSON　PIPETMAN　P-1000）
７、　解剖针（夏目制造所　Broach holder　Cat.No.E-14）
８、　酒精灯（或者台式微型煤气燃烧器　Cat.No.RK4102）
９、　CO₂培养箱（37°C　5% CO₂　95% air）

◆步骤

准备清洗胚胎用的培养皿和蔗糖溶液

１.　首先制作清洗复苏后胚胎的培养皿，静置在CO₂培养箱内30分钟以上，稳定内部气体。

２.　预先在CO₂培养箱内加热0.25 M 蔗糖溶液。

胚胎的复苏

1. 　从液氮储存器内取出冻存的EP管后，立刻打开盖子，倒掉EP管内的液氮，在室温下静置30秒。

2.　用自动移液器把0.9ml已预热到37°C的0.25 M 蔗糖溶液添加进EP管内，在蔗糖溶液完全溶进冻存液前要迅速移液（10次左右）。
　

　* 融解后的冻存液在常温下细胞毒性很强，因此需要迅速往EP管内添加0.25 M 蔗糖稀释冻存液。

移液

１.　如下图所示，首次移液需迅速把0.9mL 0.25 M 蔗糖溶液转移至EP管内加热（请注意如果枪头的尖端接触冻存液，枪头内的蔗糖溶液会冻结并阻塞在枪头的尖端）。

２.　第二次以后的移液，就按照下图蓝色箭头所示小幅度移液。

此外，第二次以后的移液，以免损坏胚胎，应小心且迅速有序地移液加热胚胎。（移液的速度请参考以下视频） 

３.   使用自动给移液器，将冻存液和蔗糖溶液的混合溶液移至培养皿上，接着用0.4~0.5mL的0.25 M 蔗糖溶液清洗EP管。

注意：移液时，尽量避免产生气泡。在混合溶液移至培养皿上时，如果溶液表面产生气泡，气泡会阻碍取回胚胎，此时可用酒精灯加热解剖针的尖端，然后刺破气泡。

胚胎复苏时移液要点：请注意，移液过程中如果枪头内有气泡，混合溶液移至在培养皿后，溶液表面产生的大量气泡会导致难以在显微镜下观察胚胎，无法取回胚胎。

４.   直接从混合溶液里取出胚胎，小心地导入预先制作好（清洗前30分钟以上开始准备）、清洗胚胎的培养皿上的KSOM/AA滴液里，静置在培养箱内10分钟。

静置10分钟后 

５.　用剩下的KSOM/AA滴液清洗胚胎两遍。

参考文献

【1】  Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and effcient procedure for cryopreservation of mouse embryos

    by simple vitrification. Exp. Anim. 46: 231-234.PDF