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qNMR技术文章2--应用NMR进行SI可溯源纯度评价

产业技术综合研究所计测标准研究部门计量标准系统科斋藤刚、井原俊英

◆序文

　　随着2003年食品卫生法中Positive List制度（2006年5月施行）的引入，食品残留农药相关物质的规制幅度强化，日本国内外流通的800种农药被列为规制对象。这不仅直接关系到我们的食品安全，也与国际贸易紧密相关，因此对其分析值的可信赖性要求较高，包含公立机关在内的各检测机构竭力提高并维持如ISO/IEC 17025认证等分析精度管理。在这些分析值精度管理中，制作检量线用的标准物质的使用是必不可少的。但即使只从视频卫生法中收录的多种物质入手，标准物质的整理公诚也不容小觑。

　　现在市面上有很多评判有机化合物纯度的标准品和制作检量线用的标准液，但是这些化合物质纯度的评判多数是采用色谱法，以JIS规格为标准的相对面积百分比¹）来判断的。这也是难以用国际单位体系可溯源法评判有机化合物纯度，和适用化合物受限的起因。面积百分比法是以对检测出的全部分子获取一定的检测感度为前提条件的，因此，样品中若含有检测感度不相同的不纯物就可能会引起纯度检测错误。差数法²）可以一定程度上规避上述问题，但检测过程中必须知道全部不纯物的标准，也难以普遍应用。因此没有被供应为计量可追溯性保证的标准物质。

　　为了回应这个问题，和光报道指出已经开发了一种新的残留农药检测用标准物质，它是一种快速便捷且可以准确计量、表达计量可追溯性的方法。

　　核磁共振（NMR）法对农药原体的纯度评价极其有效。本文将从获得计量学上准确的测定值、其简便性和广泛的适用范围出发，对其高精度性定量检测的重要条件设定进行解说。

◆NMR定量检测的应用

　　根据检测的核种不同，NMR光谱也不一样。最常用的是有机化合物构造解析所应用的氢原子NMR光谱。由于化合物汇总的官能团显示不同的共振频率，得以区分某些化合物中的官能团。另外，相邻的¹H等信息有各个峰（自旋耦合结合（J-结合））的分裂表示。因此各峰的面积与共振¹H核数成比例。这些是NMR在解析有机化合物构造时不可或缺的特点。

　　通过对高分子化合物不同官能团信号强度比的精确检测，可广泛应用于立构规整度和共聚物的单链分析等。另一方面，低分子量有机化合物则无需精确获取面积比，比如相同分子中的甲基和亚甲基的信号面积比几乎可以精确确认为3：2，无需精准检测。

　　高分子化合物的定量用必要精度和纯度评价必要精度存在差异，但可比较共聚物的不同单元间的信号强度，同时检测两种不同的有机化合物面积比获取各¹H的数量比。换而言之，因为可以比较存在溶液中两种不同凳子的分子数，NMR是直接比较物质量（mol）的方法之一，建议将限定于有机化合物领域的SI可溯源定量法实现普遍应用。

　　下面我们将整理介绍SI可追溯性定量检测时不可或缺的NMR信号面积评判法的检测要点。

◆纯度判定是NMR检测条件的设定

　　确认NMR信号强度是否定量，可通过一个分子内拥有表达不同化学位移的多个官能团的分子，检测¹H信号强度是否精确测定来实现。在比较面积时，期望在不应用窗口函数的情况下严格校正傅里叶变换频谱的相位，并尽可能多地设置和积分对应于每个峰宽的积分间隔。

　　NMR定量检测过程中，用90°脉冲激发样品时必须设定定量峰的反复操作等待的时间为最长纵缓和时间（T₁）的5倍以上并累计^5）6）。表1显示出了不同脉冲角度，T_R/T₁和缓和磁化的离乱关系。但该条件意味着90°脉冲后平衡此话强度可恢复到原来状态的99%。纯度检测中TR设定较长，偏差就会变小。例如：预期99.9%的磁化要恢复状态的话，就需要以分子内最长峰T1的７倍为目标设定T_R。用除90°脉冲以外的小角度脉冲激发样品时，与90°脉冲比较，一次累计可得信号强度60°脉冲式约为87%，30°脉冲时仅有50%。因此要求的T_R不能短，所以纯度检测时还是使用90°脉冲为佳。

表1. 平衡磁化设置为1时，T_R/T₁与缓和磁化的理论对戏与其对P_A的依赖性

	3	5	7	9	11
90°	0.95021	0.99326	0.99909	0.99988	0.99998
60°	0.97447	0.99662	0.99954	0.99994	0.99999
30°	0.99303	0.99909	0.99988	0.99998	1.00000

　　评判反复操作等待时间设定所必须的T₁大多使用Inversion Recovery法。脉冲系列以T_R -π- T_D -π/2-acquire表示，其中π和π/2分别表示180°脉冲和90°脉冲，T_D是检测T₁的变量，检测是应设置多个不同的T_D反复检测。图1表示trans –permetrin光谱，T_D十分短（T_D=6ms）和十分长（T_D=25.6）时，各峰值呈上下逆转。改变T_D，T_D短的时候光谱峰向下，T_D长时光谱峰方向逆转。峰从下方向逆转到上方向时，则可知T₁是光谱上的峰强度T_D为0是的1.44倍（l/In2）。若T_D=30s时确认全部峰是否为T1的7倍以上的话30÷7÷1.44，即设定T_D约为3s时，可充分确认到全部峰的方向都是向上的。可简单且短时间内进行实验推荐用于确认NMR定量性检测。

　　图1. 用Inversion-Recovery法和不同的T_D检测出的trans –permetrinCD₃CN溶液光谱1.94ppm和2.1ppm峰是溶剂和水来源的信号。可看出由于短T_D，T₁短峰发生反转，T₁长峰则不发生反转。

　　与反复操作等待时间的设定同等重要的是光谱幅度，使其比通常使用的光谱幅度更宽很重要。尤其需要特别注意的是没有配备过采样功能的NMR装置和数字滤波器。数字化NMR数据时用音频滤波器排除光谱外侧杂音的影响，这个影响与光谱中心附近的信号强度相比，可得知光谱两端信号强度弱。换而言之，因无法准确评判光谱两端的信号强度，所以通过扩增光谱幅度来规避上述问题是十分必要的。

　　设定这些条件之后，有望在线圈充分良好的条件下进行高信号/杂音比的光谱检测。

◆农药纯度检测应用

　　已将纯度检测不确定性控制在1%为目标，通过农药原料1HNMR进行纯度检测。在内标准物质中使用产综研认证标准物质1 , 4 -dichlorobenzene（NMIJ CRM 4039 -a）前先用经过NMR纯度校正的4 -bis（trimethylsilyl）benzene-d 4 （ 1 , 4 -BTMSB-d4）、3（- trimethylsilyl）- 1 -propanesulfonic acid-d 6 sodium salt（DSS-d6）、benzoic acid或dimethyl sulfone。将要进行纯度判定的农药原料（下面成判定样品）和内标准物质分别进行精密的称量后，加入氘代溶剂制备成溶液，在上述定量检测条件下进行检测。从得到的光谱中判定需要定量的判定样品和内标准物质的峰，通过考虑原子核数量和溶液中的摩尔比来获得定量值。此处用较为适合的典型实验条件（表2），将适用NMR实验判定样品总结在表3中。表中除了列出判定样品是否可用NMR法进行纯度判定外，同时还列出了是否适合通过差示扫描量热仪（DSC）采用凝固点降低法来进行纯度判定。PCP分子中只存在-OH信号不适合纯度检测，无法进行判定。纯度检测的不确定性与内标物质及判定样品的称量、判定峰、NMR的反复操作检测和内标物质的纯度相关外,还判定NMR信号的缓和和装置原有的偏差，担这些不确定性在哪一个判定样品上都不足1%，因而可以保证定量精度。

表2. 典型的NMR检测条件

NMR装置	Varian UNITY INOVA	Varian NMR Systems＊	JEOL JNM-ECS400
探测器	Dual Broadband	Dual Broadband	TH5-ATFG2D
1H共振频率	599.90MHz	599.90MHz	398.78MHz
观测光谱幅度	59970Hz	59523.8Hz	39904.2Hz
脉冲幅度	11μs	11μs	10μs
脉冲角度	90°	90°	90°
捕获时间	4s	4s	4s
重复等待时间	60s～90s	60s ～ 90s	60s ～ 90s
累计次数	8 or 32	8 or 32	8 or 32
虚拟扫描	2	2	2
温度	25℃	25℃	25℃
13C核解耦	只在捕获时间内	只在捕获时间内	只在捕获时间内
去耦序列	WURST408） or GARP9）	WURST40	MPF810）

*UNITY INOVA分光计更新装置

表3. NMR等纯度判定的判定样品一览表

　　同时列出了DSC凝固点降低法作为NMR的比较对象。

No.	判定样品	纯度评判法		No.	判定样品	纯度评判法
No.	判定样品	NMR	DSC	No.	判定样品	NMR	DSC
1	Trichlorfon（ DEP）	●	●	42	Glyphosate	●
2	Procymidone	●	●	43	Pyributicarb	●
3	EPN	●		44	trans-Permethrin	●
4	Etofenprox	●	●	45	Flufenoxuron	●
5	Propyzamide	●	●	46	NAC	●
6	Benthiocarb	●		47	Bensulide	●
7	Malathon	●	●	48	Chlorfl uazuron	●
8	Fenobucarb（BPMC）	●		49	Silafl uofen	●
9	Atrazine	●	●	50	Isoxathion	●
10	Echlomezol	●		51	Coumaphos	●	●
11	Pendimethalin	●	●	52	MCP	●	●
12	Bethrodine	●	●	53	Prochloraz	●
13	Chloroneb	●	●	54	Triadimefon	●	●
14	Simetryne	●	●	55	Diazinon	●
15	Thiuram	●		56	Flazasulfuron	●
16	Isoprothiolane	●	●	57	Imazosulfuron	●
17	Bifenox	●		58	Cyprodinil	●
18	Probenazole	●		59	Diflubenzuron	●
19	Pyridaphenthion	●		60	Famoxadone	●	●
20	2,4-PA	●	●	61	Trifloxystrobin	●
21	DCMU	●	●	62	Tiadinil	●	●
22	Iprodione	●	●	63	Acephate	●	●
23	MCPP	●	●	64	Thiamethoxam	●
24	Fenitrothion（ MEP）	●	●	65	Tolclofos-methyl	●	●
25	Dithiopyr	●	●	66	Warfarin	●
26	Mefenacet	●	●	67	Teflubenzuron	●
27	Bensulfuron-methyl	●		68	Linuron	●	●
28	Esprocarb	●		69	Flusulfamide	●	●
29	Mepronil	●		70	Cymoxanil	●
30	Thiophanate	●		71	Indanofan	●
31	Metalaxyl	●		72	Pyrazoxyfen	●
32	Vinclozoline	●	●	73	Thiacloprid	●	●
33	Asulam	●		74	Chlorfenapyr	●	●
34	Flutolanil	●	●	75	CNP-amino	●	●
35	Dimepiperate	●	●	76	Chloro IPC	●	●
36	Molinate	●		77	Methyl Thioacetohydroxamate	●
37	Cumyluron	●	●	78	Pyrimethanil	●	●
38	cis -Permethrin	●		79	Phosalone	●
39	Anilofos	●		80	XMC	●	●
40	PCP		●	81	Bifenthrin	●
41	Myclobutanil	●		82	Daminozide	●

◆结语

　　可见NMR可以广泛引用于保证SI可追溯性的有机化合物纯度检测。NMR纯度检测法采用适当的国家标准可简单实现SI可追溯性，是有高度信赖性的分析法。NMR定量检测法操作简便，适用范围广泛，能迅速准确对有机化合物含量进行确认，不仅在日本国内甚至在国际间都背负很高期望，我们期望本技术能有更进一步的发展。

◆定量NMR（qNMR）用内标准物质

产品编号

产品名称

规格

包装

024-17031

1,4-BTMSB-d4 Reference Material

氘代1,4-BTMSB-d4标准品

TraceSure^™

50mg

044-31671

DSS-d6 Reference Material

DSS-d6标准品

TraceSure^™

50mg

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