Wako实验动物生化检测LabAssay系列试剂盒（二）

　　使用LabAssay™ 系列细胞生物学用定量检测试剂盒，只需少量样品就可进行检测，并且一次可进行多个样品的测定。

　　目前LabAssay™ 系列有白蛋白与球蛋白比值检测试剂盒、肌氨酸酐定量检测试剂盒、葡萄糖定量检测试剂盒、游离脂肪酸定量检测试剂盒、磷脂定量检测试剂盒、甘油三酯定量检测试剂盒、碱性磷酸酶定量检测试剂盒、胆固醇定量检测试剂盒、尿酸定量检测试剂盒共9种试剂盒可供选择。

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【LabAssay™ ALP（碱性磷酸酶定量检测试剂盒）详细资料】

别名：Alkaline Phosphatase Assay Kit

摘要

　　碱性磷酸酶的活性检测试剂盒。常用于检测培养的成骨细胞、实验动物血清和骨组织中的碱性磷酸酶活性。

　　碱性磷酸酶(ALP)广泛分布于肝脏、骨、小肠之中。特别在骨代谢研究领域方面被用作为骨形成指标之一。本品是用p–硝基苯磷酸作为底物的碱性磷酸酶检测试剂盒，利用微孔板，可进行多种样品的检测。

【检测原理】 

　　样品在含有p-硝基苯磷酸的碳酸盐缓冲液(pH9.8)中反应，在样品中的碱性磷酸酶作用下，p-硝基苯磷酸分解为p-硝基酚和磷酸。生成的p-硝基酚为碱性，呈黄色。根据测量其405nm的吸光值，计算出样品中碱性磷酸酶的活性。

■LabAssay™ ALP [p-硝基苯磷酸基质法]

【性能】
・检测范围：>0.06 mmol/L
・标准曲线范围：0～0.5 mmol/L
・再现性：C.V.<10%

【试剂盒组成】
・底物---------------------20片（溶解时：p-硝基苯磷酸二钠  6.7mmol/L)
・底物溶解液-------100mL×1瓶（2.0mmol/L氯化镁含有0.1mol/L碳酸盐缓冲液pH9.8)
・反应终止液-------100mL×1瓶（0.2mol/L氢氧化钠溶液）
・标准液---------------10mL×1瓶（0.5mmol/L  p-硝基酚溶液）

【试剂的配制】

1）底物缓冲液：1片底物溶解于5mL底物溶解液中。

2）反应终止液：直接使用。

3）系列稀释标准液：将标准液用蒸馏水依次稀释为0.5、0.25、0.125、0.0625 mmol/L等2倍率稀释液系列。

【标准操作法】

　　向96孔微孔板内添加100μL底物缓冲液和20μl样品，在微孔板震荡器上充分振荡1分钟后，37℃孵育15分钟。

　　　添加80μL反应终止液，在微孔板震荡器上充分振荡1分钟后，用酶标仪测量405nm处的吸光值。同样方法进行空白(蒸馏水)对照和标准品的检测。

【活性单位的定义】
　　在pH9.8，37℃情况下，1分钟内生成1nmol p-硝基酚所需的酶的活性为1个活力单位（U）。

活性（U/μl）= C/15 ×a　
　C：由标准曲线得到的OD值(A实验值减去A空白值)，计算p-硝基酚浓度(mmol/L=nmol/μl)       15：反应时间(min.)
　a：样品的稀释倍数

当样品为成骨细胞时，本试剂盒使用前需要预处理

・在48孔板上进行细胞培养后，除去培养基，用PBS冲洗感光板，各孔添加150μL 0.05%的曲拉通X，进行冻结→融化→冻结→融化操作。4℃，15,000rpm离心15分钟处理，将上清液移到新的辅助管，以此作为样品。

(注1）48孔板：培养时，一般不采用96孔板，多使用48孔板。

(注2) 曲拉通X的作用：溶解细胞膜，回收蛋白(细胞内含有ALP蛋白)的试剂。

(注3) 反复的冻结融化：原理不明，但这样做似乎可以提高ALP活性。

(注4) 也有不使用曲拉通X，用超声波降解法(超声波处理)对细胞造成物理性休克得到溶解产物的方法。

(注5) 曲拉通X的添加量：以150μL为例，孔中细胞约为20,000cell。

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【LabAssay™ Cholestero（胆固醇定量检测试剂盒）详细资料】

摘要

　　胆固醇是生物细胞膜的主要成分，是众多动物合成甾族化合物的前体物质。

　　本品是利用N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠(DAOS)，通过酶浅蓝色显色反应，检测血清等样品中胆固醇量的试剂盒。与微孔板配套使用，可进行多样品检测。

【检测原理】

　　样品中的胆固醇酯类在胆固醇酯酶作用下，被分解为游离胆固醇和脂肪酸。在这里生成的游离胆固醇与既存的游离胆固醇类一起被胆固醇氧化酶氧化，产生过氧化氢。生成的过氧化氢，在过氧化物酶作用下，与N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠(DAOS) 及4-氨基安替比林定量氧化缩合，产生浅蓝色色素。测量这个浅蓝色色素的吸光值，即可计算出样品中的胆固醇浓度。

■LabAssay™ 胆固醇[胆固醇氧化酶、DAOS法]

胆固醇是动脉硬化等血管疾病的致病原因之一。

【试剂盒组成】

・缓冲液-----------------------------150mL×2瓶(MES缓冲液)
・显色剂----------------------150mL用×2瓶

(溶解时：胆固醇酯酶，胆固醇氧化酶，过氧化物酶，DAOS，4-氨基安替比林，抗坏血酸氧化酶)
・标准液---------------------------10mL用×1瓶

【性能】
・灵敏度
蒸馏水作为样品时，吸光值在0.11以下。

特定浓度的标准液(200mg/dl) 作为样品时，吸光值为0.13～0.65。
・特异性
可检测1,000mg/dl的总胆固醇浓度。

【检测波长】
主波长：600nm, 副波长：700nm

【试剂的配制】
■显色剂：将1瓶显色剂(150mL用)溶解于1瓶缓冲液(150mL)中。

配制后，以2～10℃保存，可保存3星期。

【标准操作法】

向微孔板内添加2μL样品和300μL显色剂，充分混合，在37℃孵育5分钟。以此作为对照空白值，测量样品及标准液的吸光值。

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