生命科学领域中的成像常用于观察对象形态和结构、分布和定位以及动力学和相互作用，根据使用的显微镜、观察对象和样品类型选择不同的成像方法。FUFJIFILM Wako提供适用于新型成像技术如组织透明化和光电关联显微镜（CLEM）的各类试剂，以及成像常用的发光/荧光探针。
◆成像所需的设备和试剂
显微镜
显微镜可以通过放大观察到肉眼无法看到的微小样品。然而组织和细胞的组成成分对光的透过性接近，由于对比度较低，难以识别其形态和结构。因此当使用常规光学显微镜进行观察时，需通过染色或光学处理增加对比度。此外还有其他多种类型的显微镜包括荧光显微镜和电子显微镜等（表1）。
表1：常见显微镜的特征和用途
显微镜类型 | 特点 | 用途 |
明视野显微镜 | 常用的光学显微镜，光源照亮整个视野，通过染色增强对比度。 | 观察染色样品 |
暗视野显微镜 | 从样品的侧面打光，并观察散射光。 | 观察非染色样品 |
相差显微镜 | 将样品折射率差异产生的衍射光和直射光的相位差，转换为明暗特征，观察由此 产生的对比度。 | 观察无色透明试剂 |
微分干涉显微镜 | 将样品内光路长度（折射率×厚度）的梯度转换为明暗特征，观察由此产生的对 比度。 | 观察无色透明试剂 |
荧光显微镜 | 将激发光照射到样品中的荧光物质上，对发出的荧光进行处理后形成图像。 | 观察使用荧光染料标记的细胞 和组织 |
共聚焦显微镜 | 通过使用点光源和针孔将光线聚焦到样品内部，可非侵入性地获取切片的高分 辨率图像。 | 细胞和组织的三维观察 （通常使用荧光染料标记） |
扫描显微镜 | 使用电子束扫描样品，观察从二次电子和反向散射电子中获得的图像。 | 观察样品表面的微结构 |
透射电子显微镜 | 使用电子束照射样品，观察从透射电子获得的图像 | 观察样品内部的微结构 |
光电关联显微镜法（CLEM）是使用光学显微镜和电子显微镜观察同一样品，并 比较其图像来分析细胞内细胞和细胞分子定位和形态的方法。 由于荧光染料会褪色，通过传统方法难以对同一切片使用光学显微镜和电子显微 镜观察，但使用FUJIFILM Wako的荧光恢复试剂可对同一切片进行反复观察。 |
图1：CLEM法中电子显微镜和荧光显微镜的重叠图像 |
前处理试剂
使用显微镜观察组织和细胞时，需要固定和维持样本的原始状态。通常使用福尔马林等交联生物分子固定样本，同时防止分解和腐败。当使用抗体进行蛋白质检测时，需使用可渗透细胞膜的表面活性剂（TritonX-100）或有机溶剂进行处理。此外根据实验情况，可能还需要去除或封闭不必要的染料或探针，以防止抗体的非特异性结合。
聚焦-透明化试剂- 生物组织中含有各种不同折射率的物质，它们会导致光散射。 因此生物组织透明化时，需要去除组织中高折射率的成分，或用高折射率液 体替代溶液，或同时采取两种措施，从而使组织折射率统一化。 通过组织透明化，可实现深部组织成像和高分辨率观察。 |
图2：透明化试剂处理的小鼠大脑 （左：未处理，右：处理后） |
探针
观察特定的细胞、分子和生命现象时需根据观察对象选择特异性探针，以下将介绍成像常用的发光/荧光探针。
发光探针
发光探针被化学反应激发，并在其恢复到基态时发光。发光依赖于化学反应，因此该技术具有高选择性、低噪声，并产生强信号。由于其动态范围宽，常用于分析ATP和钙离子的动力学。典型的发光探针有荧光素-荧光素酶 (FLuc)、脱辅基水母发光蛋白和海肾荧光素酶 (RLuc)-腔肠素。
荧光探针
荧光探针首先被光激发，并在其恢复到基态时重新发射光。与发光探针相比，荧光探针的优势在于无需反应底物，只需使用激发光即可获得信号。荧光探针的缺点则在于生物体中除荧光探针以外还存在其他荧光物质，因此与发光探针相比，它的噪声高且动态范围窄。
常用的荧光探针包括罗丹明和荧光素等有机荧光染料，以及GFP等荧光蛋白。FUJIFILM Wako可提供各种专用于标记细胞和细胞器，以及功能分析用的探针（表2）。
表2：针对不同观察对象的荧光探针
观察对象 | 目标和荧光探针 |
细胞形态和运动 | 细胞骨架（肌动蛋白丝、微管、中间丝） |
特定的细胞和细胞器 | 细胞核 可将染料注射到神经元内标记神经元和神经回路。注入细胞内用于标记神经末梢的染料称为“顺向示踪剂”， 而注入神经末梢用于标记细胞的染料则称为“逆向示踪剂“，如羰花青染料和葡聚糖金。 |
定位生物分子 | 核酸 使用目标蛋白质特异性抗体，一抗直接与荧光团结合，或使用荧光染料标记的二抗检测。如无合适的抗体， 目标蛋白可通过亲和标签或荧光蛋白进行标记并表达。 多糖 |
细胞内活动 | 细胞内信号转导 使用荧光强度随钙浓度变化的钙敏感探针观察与钙相关的细胞内信号转导，钙探针包括水母发光蛋白、Indo1、 Fluo4 和 Fura2。 pH值变化 pH敏感探针的荧光强度与pH值变化相关，使用pH敏感探针可检测自噬过程中溶酶体融合和内容物降解。 典型的pH敏感荧光探针有BCECF和SNARF-1。 |
相互作用 | 蛋白质相互作用 两种蛋白的相互作用基于荧光共振能量转移（FRET）原理，使用不同的荧光染料（如CFP和YFP）分别标记两种 蛋白质，当两者靠近时，其中的一种荧光会激发另一种。 |
◆参考文献
1. GFP and Bioimaging”ed. by Miyawaki, A., Yodosha, Japan, (2000). (日文)
2. "How to select and use fluorescent and luminescent reagents for successful experiments”ed. by Miwa, Y., Yodosha, Japan, (2007). (日文)
3. "Handbook for Staining and Bioimaging Experiments 5th ed.” ed. by Takata, K., Saito, N. and Kawakami, H., Yodosha, Japan, (2012). (日文)
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