◆评价ULTRARIPA® Kit B buffer 单独提取脂筏蛋白的能力
（数据提供：东京大学 大学院药学系研究科 卫生化学教室）
用PBS清洗COS-1细胞后，用SDS buffer、1％ Triton X-100 buffer，ULTRARIPA® Kit A buffer以及ULTRARIPA® Kit B buffer溶解，离心（14,000 rpm, 5 min, 4°C）。分离可溶性组分和不溶性组分。不溶性组分用等量的SDS-PAGE sample buffer变性溶解。通过SDS-PAGE / Western印迹评价脂筏标记物中Flotilin 1的可溶解量。在普通1％Triton X-100和RIPA缓冲液中，大部分的Flotilin 1保留在不溶性膜组分中，然而在ULTRARIPA® Kit B缓冲液中几乎全部溶解了。
各缓冲液的成分：
| ● | SDS buffer（2％SDS, 1％ Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150 mM NaCl） |
| ● | ULTRARIPA® Kit A buffer (1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mM Tris-HCl (pH8.0)，150 mM NaCl，0.5％ Sodium Deoxycholate) |
| ● | ULTRARIPA® Kit B buffer （不公开成分） |
| ● | 1％ Triton X-100 (1％ Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150 mM NaCl） |
◆用ULTRARIPA® Kit观察NGF刺激依存的Integrin的脂筏转换
（数据提供：国立精神·神经医疗研究中心 神经研究所 疾病研究第五部）
使用的样本：小鼠来源原代培养DRG神经细胞（DIV13，～106 cells/35 mm dish）
目标蛋白：Integrinβ1, Flotillin 1
步骤：
1．在存在和不存在50ng/mL NGF的情况下培养神经细胞（各准备2个样品）
2．用PBS清洗COS-1细胞后，添加150 μL ULTRARIPA® Kit A-buffer，并在冰上孵育
3．离心分离可溶性组分①和不溶性组分
4．准备的2个A-buffer不溶性组分的样品，其中一个管添加150 μL 1× SDS sample buffer使其完全溶解②
5．添加150 μL B-buffer至另一管A-buffer不溶性组分中，悬浮沉淀物
6．离心并分离B-buffer可溶性组分③和不溶性组分
7．添加150 μL 1× SDS-PAGE sample buffer至B-buffer不溶性组分中，使其完全溶解④
结果：
与NGF刺激中未看到Flutillin的波动相比，观察到了Integrinβ1通过NGF浓缩在RIPA不溶性部分中。
◆使用ULTRARIPA® Kit分析神经突触相关蛋白的可溶性和复合物
（本数据是在Funakoshi与学习院大学理学部 高岛明彦教授，住冈晓夫助教共同研究下取得）
■ 直接添加B-buffer验证溶解效率
使用的样本：小鼠脑组织（海马体+大脑皮质）来源的P2膜组分*
*P2模组分的回收步骤
从小鼠脑组织切除海马体以及大脑皮质，添加匀浆缓冲液（10 mM HEPES (pH 7.4), 0.32 M Sucrose, protease inhibitors）并用Dounce型匀浆器破碎。
低速（×1,000 g）10分钟离心组织破碎液，去除沉淀的核组分（P1组分）。
上清（S1）组分用中速（×13,200 g）20分钟进一步离心，去除上清（S2）组分，回收沉淀的膜（P2）。
使用缓冲液条件：
SDS：2％ SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl
1％ Triton：1％ TritonX-100, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl
ULTRARIPA® Kit
A-buffer(RIPA)：1％ NP-40, 0.5％ deoxycholate, 0.1％ SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl
B-buffer：非公开
步骤：
1． 添加各缓冲液100 mL至P2组分中，在冰上进行超声处理
2． 高速（×100,000 g）离心破碎液，沉淀不溶性组分，回收各可溶性组分
3． 添置100 μL 2% SDS缓冲液至各不溶性组分并使其溶解。
结果：
在经过验证的所有神经突触相关蛋白中，ULTRARIPA® Kit B-buffer的溶解效率比1％Triton X-100和RIPA缓冲液（A-buffer）高。
■ 验证神经细胞膜来源RIPA不溶性组分的B-buffer溶解效率
使用的样本：小鼠脑组织（海马体+大脑皮质）来源的P2膜组分
步骤：
1． 添加200 μL A-buffer（RIPA）至P2膜组分，在冰上进行超声处理
2． 高速（×100,000 g）离心破碎液，除去可溶性组分，单独分离不溶性组分。
3． 添加200 mL 2% SDS，A-buffer或B-buffer至A-buffer不溶性组分，在冰上进行超声处理
4． 离心（×100,000 g）各溶液，并分离可溶性组分和不溶性组分
5． 为了检测B-buffer不溶性组分中残留的蛋白，添加2% SDS至B-buffer组分中使其完全溶解
结果：
发现B-buffer能够溶解神经细胞膜的RIPA不溶性组分中包含的大多数蛋白。
此外，还可以高效提取NMDA型谷氨酸受体亚基的GluN1和GluN2B。
另一方面，尽管PSD 95的可溶性有所提高，但发现它仍残留在B-buffer的不溶性组分中。
■ 使用ULTRARIPA® Kit分析神经突触蛋白复合物
使用的样本：小鼠脑组织（海马体+大脑皮质）来源的P2膜组分
目标：NMDA型谷氨酸受体NMDAR（GluN1/GluN2B）
AMPA型谷氨酸受体 AMPAR（GluA1/GluA2）
步骤：
| 1． | 添加ULTRARIPA® Kit B-buffer至P2膜组分，在冰上进行超声处理； |
| 2． | 高速离心（×100,000 g）破碎液，获取可溶性组分； |
| 3． | 添加1 μg对照IgG或抗GluN2B抗体或GluA2/3抗体至100 μL可溶性组分，并在4°C下反应1小时后，添加20μL bed vol Protein A磁珠并反应1小时； |
| 4． | 用PBST（0.05% Tween20 in PBS）清洗磁珠3次； |
| 5． | 添加1×SDS-PAGE样本缓冲液，在100°C加热条件下洗脱。 |
结果：
使用ULTRARIPA® Kit B-buffer，NMDAR，AMPAR都能通过免疫沉淀特异性的检测出复合物。
＊SYN (Synaptophysin)
相关产品信息请点击文字：UltraRIPA 脂筏提取缓冲液套装
| 免责声明 |
|
1. 本公司密切关注本网站发布的内容，但不保证发布内容的准确性、完整性、可靠性和最新性等。 2. 本公司不保证使用本网站期间不会出现故障或计算机病毒污染的风险。 3. 无论何种原因，使用本网站时给用户或第三方造成的任何不利或损害，本公司概不负责。此外，对于用户与其他用户或第三方之间因本网站发生的任何交易、通讯 3. 或纠纷，本公司概不负责。 4. 本网站可提供的所有产品和服务均不得用于人体或动物的临床诊断或治疗，仅可用于科研等非医疗目的。如任何用户将本网站提供的产品和服务用于临床诊断或治 4. 疗，以及其他特定的用途或行为，本公司概不保证其安全性和有效性，并且不负任何相关的法律责任。 |
