UltraRIPA kit for Lipid Raft
大幅度提升膜蛋白提取效率的新一代 RIPA 缓冲液
与常规的非变性细胞裂解缓冲液（RIPA buffer, 1% Triton X-100 等）相比，这款缓冲液套装（Buffer Kit）能迅速且高效地提取增溶相对困难的脂筏（Lipid Raft）蛋白质。从常规缓冲液中不可溶而丢弃的膜组分中，在维持蛋白质功能的情况下能实现高效地提取，有利于对脂筏等蛋白质的功能分析。
※本产品仅限于研究用。不可用于临床治疗。
◆细胞膜上的不溶性成分——脂筏（Lipid Raft）
裂解细胞进行蛋白质功能分析的时候，经常会使用 RIPA （Radio-Immuno Precipitation Assay）缓冲液和1% Triton X-100 缓冲液等的相对温和的细胞膜裂解缓冲液。这些缓冲液对蛋白质的构造和功能的影响小，适用于酶活性试验、免疫沉降和各种结合实验等蛋白质的功能分析。另一方面，与具有很强的蛋白质变性作用的 SDS 缓冲液相比，增溶能力较弱，完全不能溶解以脂筏（Lipid Raft）为主的细胞膜组分。许多表面活性剂都不能溶解脂筏，故其又被称为 Detergent Resistant Membrane（DRM）。DRM中所含蛋白质的功能分析被认为是十分困难的。
脂筏（Lipid Raft）是由胆固醇（cholesterol）和鞘磷脂（sphingomyelin），GPI锚定蛋白（GPI anchor protein）和棕榈酰化（palmitoylation）蛋白质组成的细胞膜构造，被认为是整合各种功能蛋白的功能域。神经细胞突触和免疫细胞的免疫突触是脂筏的代表性例子。
脂筏示意图
◆特点
● | 操作简单，能快速提取脂筏蛋白 |
● | 使用两种类型的缓冲液（A buffer，B buffer）进行两个阶段的提取。先提取出胞浆蛋白和非脂筏蛋白，然后提取脂筏蛋白 |
● | Buffer 提取的任何蛋白质都不会失活 |
● | A buffer 和一般的 RIPA buffer 成分相同＊。B buffer 含有表面活性剂，可以通过透析除去 |
● | 适用于哺乳动物细胞/组织 |
● | 使用本品配制的溶解液适用于酶活性试验、免疫沉淀（Immunoprecipitation）、蛋白定量（BCA 法）、SDS-PAGE 和 Western blot 等 |
＊ | 1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mMTris-HCl (pH8.0)，150 mMNaCl，0.5％ Sodium Deoxycholate |
◆缓冲液套装组成
● A buffer (RIPA buffer) （100 mL）
● B buffer（10 mL）
◆使用方法
| 1、 | 用 A buffer 溶解组织或培养细胞。 |
| ※ | 为了提高溶解效率，推荐使用均质或超声波破碎设备。 |
| 2、 | 进行离心分离，使 A buffe r中可溶性组分（上层清液）和不溶性组分（沉淀）分离，分别回收。上层清液 A buffer 可溶性组分中主要含有胞浆蛋白和非脂筏蛋白。 |
| 3、 | 往沉淀的 A buffer 不溶性组分中加入 B buffer，形成悬浊液。 |
| 4、 | 进行离心分离，与步骤2一样分离出可溶性组分（上层清液）和不溶性组分（沉淀），分别回收。上层清液的 B buffer 可溶性组分中含有脂筏蛋白。 |
| 5、 | 可应用于各种实验。 |
| ※ | A buffer 和 B buffer 不可用于 Bradford 法蛋白质定量。蛋白质定量请使用 BCA 检测。 |
| ※ | 使用本品 A buffer 和 B buffer 进行两个阶段的提取是最适宜的，也有只对细胞使用 B buffer 进行溶解和提取的例子。具体请参照以下例子。 |
UltraRIPA kit 、1% SDS buffer和RIPA buffer的比较
蛋白分离 | 蛋白结构 | 蛋白功能 | 应用 | |||
胞质蛋白 | 膜蛋白 | |||||
非脂筏蛋白 | 脂筏蛋白 | |||||
＞1%SDS buffer | ○ | ○ | ○ | ╳ | ╳ | SDS-PAGE |
RIPA buffer | ○ | ○ | ╳ | ○ | ○ | 酶分析法测定 免疫沉淀 SDS-PAGE等 |
UltraRIPA | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ | |
◆应用例
从脂筏中提取总蛋白
用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全脑组织后，回收 A buffer 不溶性组分（RIPA-insoluble fraction），添加２% SDS，RIPA buffer 和 UltraRIPA kit B buffer 进行提取。提取后的总蛋白用 SDS-PAGE/银染色检测（左），用 BCA 法定量蛋白质（右）。相对于具有很强的蛋白质变性作用的２% SDS 缓冲液，UltraRIPA kit 能够提取 70% 以上的蛋白质。
※不能保证全部蛋白质的可溶性都得到改善。
脂筏标记蛋白的提取
用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全脑组织后，回收 A buffer 不溶性组分（RIPA-insoluble fraction），添加２% SDS，RIPA buffer 和 UltraRIPA kit B buffer，提取后进行 SDS-PAGE。利用对应脂筏标记蛋白的抗体进行 Western blot 检测。
脂筏标记蛋白的免疫沉淀
用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全脑组织后，回收 A buffer 不溶性组分，通过 B buffer 提取脂筏标记蛋白。对 buffer 提取物使用脂筏标记蛋白 PSD95 的抗体和Ｇ蛋白偶联磁珠进行免疫沉淀。使用银染色和抗 PSD95 抗体通过 Western blot 检测进行确认。
提取的蛋白质的酶活性测定
用１%TritonX100，RIPA buffer，UltraRIPA kit B buffer 和２%SDS 溶解 CHO 细胞，测定溶解物中乳酸脱氢酶（LDH）的活性。２%SDS 具有很强的蛋白质变性作用，在几乎完全失活的情况下，１% Triton X100，UltraRIPA kit A buffer，和 UltraRIPA kit B buffer 所得的酶活性大致相同。
从脂筏中提取功能蛋白
用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全脑组织后，回收 A buffer 不溶性组分。用 A buffer 分三次冲洗不溶性组分，消除 RIPA 可溶性组分中脱磷酸酶的活性。往不溶性组分中分别添加２% SDS buffer，A buffer（RIPA buffer）和 B buffer，测定各种提取物的总脱磷酸化酶活性。下图是各缓冲液从 RIPA 不溶性组分中提取的蛋白质的量（左轴：黑）和所检测的脱磷酸酶的活性（右轴：红）的示意图。２% SDS buffer 能够从 RIPA 不溶性组分中很好地提取蛋白质，但容易导致蛋白质变性，完全失去脱磷酸化活性。RIPA buffer 不能提取蛋白质，活性也无法检测。UltraRIPA kit B buffer 所提取的蛋白质大约为２% SDS buffer 的 70%，且可以检测出较强的脱磷酸化活性。
UltraRIPA kit B buffer 单独提取脂筏蛋白的可能性评价
※数据提供：东京大学药学院研究生院保健化学系
用 PBS 冲洗 COS-1 细胞，分别使用 SDS buffer，1% Triton X-100 buffer，UltraRIPA kit A buffer 和 UltraRIPA kit B buffer裂解，通过离心分离（14,000 rpm，5 min，4℃）可溶性组分和不可溶性组分。不可溶性组分用等量的 SDS-PAGE 样品缓冲液变性溶解。脂筏标记 Flotilin1 的可溶部分通过 SDS-PAGE/western blot 测定。使用１% Triton X-100 和 RIPA buffer，大部分的 Flotilin 1 不溶性膜组分没有被溶解，而 UltraRIPA kit B buffer 几乎可以全部溶解。
◆各buffer组成
| ● | SDS buffer（2%SDS, 1% Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150 mM NaCl） |
| ● | UltraRIPA kit A buffer (1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mM Tris-HCl (pH 8.0)，150 mM NaCl， 0.5％ Sodium Deoxycholate) |
| ● | UltraRIPA kit B buffer (成分保密) |
| ● | 1% Triton X-100 (1% Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150mM NaCl） |
欲了解更多相关产品信息，请点击文字：ULTRARIPA® Kit 应用数据
欲了解更多产品信息，可点击文字下载PDF：ULTRARIPA® Kit for Lipid Raft
Q-1． | 如果单独使用Ｂ缓冲液，溶解效率是否高于 RIPA 缓冲液？ |
A-1． | Ｂ缓冲液的溶解活性比 RIPA（Ａ缓冲液）高。本试剂盒的操作分为２个阶段，首先将 RIPA 不溶性组分回收并用Ｂ缓冲液将其溶解，并以浓缩和简单提取 RIPA 不溶性组分中含有的脂筏蛋白为目的而进行第２阶段的操作。但是，如果是直接用Ｂ缓冲液处理样本的时候，溶解率的确比 RIPA 高。 |
Q-2． | 使用 ULTRARIPA® Kit 是否只可以提取脂筏蛋白？ |
A-2． | 多数研究认为，脂筏的细胞膜穴样内陷和神经突触中含有的组成蛋白不能用 Triton X-100 等温和的表面活性剂溶解，因此认为表面活性剂的不溶性组分（DRM）是生化脂质筏。本产品着眼于 RIPA 不溶性组分富含的脂筏蛋白，用Ｂ缓冲液进一步使其溶解，使得脂筏蛋白在非变性状态下溶解。因此，即使不是脂筏，只要是不溶于 RIPA 的样本，都可以使用本试剂盒进行检测（关于核蛋白的污染参见 Q-3）。本试剂盒使用溶解能力较高的 RIPA 缓冲液作为Ａ缓冲液，但是也可以用１% Triton X-100 等的裂解缓冲液代替 RIPA 缓冲液。 |
Q-3． | 推荐使用均质或超声破碎设备，单独使用涡旋和移液是否不够充分？ |
A-3． | 本产品采用Ａ缓冲液溶解后离心，并回收 RIPA 不溶性组分这样简单的步骤。因此，如果有细胞/组织的未破碎物或核残留的话，则可能污染 RIPA 不溶性组分。特别是 RIPA 缓冲液的核溶解效率较弱，如果不添加物理破碎，则核可能会大量残留在 RIPA 不溶性组分中。另一方面，由于Ｂ缓冲液的核溶解率较高，如果有核残留的话就会释放出 DNA，使溶液变浑浊。在Ａ缓冲液溶解时进行超声处理的话可以破坏核以及使基因组 DNA 片段化。核的污染可能会影响后续的应用，因此，我们强烈推荐使用均质或超声破碎设备。 |
Q-4． | Ｂ缓冲液的成分是什么种类的表面活性剂。听说表面活性剂的种类会影响电泳，我想知道它的成分。 |
A-4． | 非常抱歉，Ｂ缓冲液的成分是非公开的。 我们无法告诉您表面活性剂的种类。然而，我们可以确定Ｂ缓冲液不会影响电泳。 |
Q-5． | 几乎无法看见Ａ不溶性组分。即使添加了Ｂ缓冲液也无法获取蛋白质量，怎么办？ |
A-5． | RIPA 缓冲液可以溶解90~95%包括膜蛋白在内的总蛋白（根据组织/细胞种的不同多少会有点差别）。因此，考虑蛋白质总量时，RIPA 不溶性组分中含有的蛋白为样本总体的10%以下。肉眼无法看见 RIPA 不溶性组分时，需要增加细胞数/组织量。想要提高Ｂ缓冲液溶解组分蛋白浓度时，减少添加至 RIPA 不溶性组分的Ｂ缓冲液的量就可以得到改善。我们建议您可以设置如下的阳性对照。 |
| 探讨样本量的阳性对照实验 需要准备的试剂：２% SDS缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0）,150 mM NaCl，２% SDS） 步骤：回收 RIPA 不溶性组分后，添加２%SDS缓冲液，通过进行蛋白质定量检测，可以预估 RIPA 不溶性组分中含有的蛋白质总量。 | |
Q-6． | 在Ａ缓冲液溶解组分中可以观察到脂筏标记物，有什么改善的方法吗。 |
A-6． | 我们无法保证在其他方法中作为脂筏标记物被检测出的蛋白能否在Ａ缓冲液不溶性组分中获得。特别是根据脂筏标记物的不同，细胞种类/组织，有无外部信号也会有变动。我们会根据以下案例提供相关的改善方法，请酌情参考。 例1：不溶于1％Triton X-100，但用RIPA缓冲液可以检测出可溶性组分。 改善方法：可能是由于RIPA缓冲液（1%NP-40，0.1% SDS,0.5% sodium deoxycholate）的提取效率比1％Triton X-100强，所以能将其溶解。这时候，可以通过用1％Triton X-100缓冲液代替A缓冲液来浓缩以及溶解目的蛋白。 例2：离心条件不足时，虽然不溶解，但是不沉淀。 改善方法：虽然我们推荐的离心条件为10,000×g，但是根据目的蛋白的不同，离心10,000×g可能不足。这时，也有把离心条件调整为20,000×g之后得到改善的案例。因此，我们建议您可以探讨一下离心条件。 |
Q-7． | 用B缓冲液洗脱的蛋白可以用于质谱分析吗？ |
A-7． | B缓冲液溶解的蛋白经过SDS-PAGE分离后，可以通过一般的蛋白质组学分析的顺序（切割凝胶，在凝胶中进行胰蛋白酶消化，提取肽以及脱盐操作）进行分析。 |
Q-8： | 用B缓冲液提取后，我想用适合试验的缓冲液来置换它。 可以通过透析去除B缓冲液的表面活性剂吗？ |
A-8： | B缓冲液含有的表面活性剂可以通过透析去除。请使用孔径为5 kDa的透析膜。但是，也有根据蛋白质的不同，在去除表面活性剂时也可能会聚集或变性，需要添加别的表面活性剂到透析缓冲液中。建议进行预实验。 |
| 产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 | 备注 |
| F015 | UltraRIPA kit for Lipid Raft | 1kit | － | － |
| 免责声明 |
|
1. 本公司密切关注本网站发布的内容，但不保证发布内容的准确性、完整性、可靠性和最新性等。 2. 本公司不保证使用本网站期间不会出现故障或计算机病毒污染的风险。 3. 无论何种原因，使用本网站时给用户或第三方造成的任何不利或损害，本公司概不负责。此外，对于用户与其他用户或第三方之间因本网站发生的任何交易、通讯 3. 或纠纷，本公司概不负责。 4. 本网站可提供的所有产品和服务均不得用于人体或动物的临床诊断或治疗，仅可用于科研等非医疗目的。如任何用户将本网站提供的产品和服务用于临床诊断或治 4. 疗，以及其他特定的用途或行为，本公司概不保证其安全性和有效性，并且不负任何相关的法律责任。 |
