使用PS亲和法分离的MSC来源细胞外囊泡具有较高的抗炎和抗纤维化作用
细胞外囊泡（EVs）是由细胞释放的微小脂质双分子层颗粒。如今，细胞外囊泡由于可以传递生物活性脂质、蛋白质和核酸，被公认为是细胞间通讯的重要信使。间充质干细胞（MSC）来源的细胞外囊泡，正成为未来再生医学中颇具前景的治疗策略。本文将介绍一种细胞外囊泡分离技术——PS亲和法，以及目前为止在再生医学中发现的实用性。
◆细胞外囊泡（EVs）
细胞外囊泡，包括外泌体和微囊泡，是由细胞释放的小于1,000 nm的脂质双层颗粒，同时带有标记蛋白CD9、CD63和CD811）。细胞外囊泡包含蛋白质、DNA、RNA和脂质等细胞成分，被认为是通过转移这些成分来进行细胞间的交流。
◆MSC来源细胞外囊泡
MSC是来源于间充质的干细胞，可以分化为脂肪、骨骼和软骨。MSC可以从骨髓、脂肪组织或脐带建立，使其成为有前景的未来再生医学的来源。已知MSC具有某些旁分泌效应，包括免疫抑制、抗炎和抗纤维化。最近的报告显示，这些影响是由MSCs释放的细胞外囊泡（EVs）引起的3），这也是MSC来源细胞外囊泡（EVs）疗法受到关注的原因。
◆新型细胞外囊泡（EVs）分离技术-PS亲和法-
分离细胞外囊泡包括以下几种方法：已经经过长期应用的超速离心、密度梯度离心及针对表面抗原的抗体亲和法4）。但是以上方法存在诸如回收率低、纯度低、不能收集完整囊泡、再现性差等问题。 对此，富士胶片和光与金泽大学的华山教授合作共同开发了一种新的PS亲和法，该方法可捕获表达于细胞外囊泡表面的磷脂酰丝氨酸（PS）5）。PS亲和法利用的是与PS钙依赖性结合的Tim4蛋白。Tim4蛋白虽能与PS牢固结合，但也可由Ca2+螯合剂（如EDTA）释放。利用该特性，可开发出比传统方法的回收效率、纯度、收集完整囊泡和可重复性更佳的细胞外囊泡分离方法（图1）。
图1
A）通过PS亲和法进行的细胞外囊泡步骤
B）通过PS亲和法或UC分离EVs的透射电子显微镜图。箭头表示EVs。
◆PS亲和法可分离具有高活性的MSC来源细胞外囊泡
接下来要介绍的是我们最近在分离MSC来源细胞外囊泡中发现到的PS亲和法的价值。首先，通过PS亲和法或超速离心法（UC）从骨髓来源的MSC条件培养基中分离出细胞外囊泡。然后，通过PS ELISA比较每种分离方法的回收效率，一种PS亲和技术的细胞外囊泡定量法（图2A）。通过检测CD9、CD63或CD81分析细胞外囊泡的定量。结果显示，UC回收率为40％，而PS亲和法回收率为80％以上（图2B）。
图2
A）PS ELISA的原理
这是一种对细胞外囊泡进行定量的原创性技术，通过固定化Tim4蛋白和检测抗体分别实现捕获细胞外囊泡和检测细胞外囊泡的表面抗原。
B）通过PS亲和法或UC法分离的MSC来源细胞外囊泡的定量检测
检测抗体是抗CD9抗体、抗CD63抗体或抗CD81抗体。该图显示的是相对值，其中培养基的细胞外囊泡数量为100％。
PS ELISA法：PS CaptureTM外泌体ELISA试剂盒（链霉亲和素HRP）（298-80601；包括抗CD63抗体），抗CD9抗体（019-27953），抗CD81抗体（011-28111）。
此外，我们比较了每种方法分离出来的MSC来源细胞外囊泡活性并进行实验，以评估外周血单个核细胞（PBMC）的抗炎作用和正常人胎儿肺二倍体成纤维细胞（TIG3细胞）的抗纤维化作用。结果表明，通过PS亲和法分离的MSC来源细胞外囊泡比通过UC分离的细胞外囊泡具有更高的活性（图3、4）。
图3. MSC来源的细胞外囊泡对LPS诱发的炎症的作用
用LPS刺激由PBMC分离出的单核细胞来诱导炎症，然后添加由各方法分离出的4.5×108粒子/ mL细胞外囊泡。结果发现，MSC来源的细胞外囊泡抑制了TNFα和IL-6基因表达的增强以及TGFβ基因表达的降低。PS分离的细胞外囊泡比UC分离的细胞外囊泡更具抑制作用。
图4. MSC来源的细胞外囊泡对纤维化的影响
用TGFβ刺激TIG3细胞并诱导纤维化相关基因增强表达，随后添加由各方法分离的1×109 粒子/ mL的细胞外囊泡。MSC来源的细胞外囊泡抑制了胶原III、αSMA和胶原V基因的升高，PS分离的细胞外囊泡比UC分离的细胞外囊泡更具抑制作用。
这个结果显示，PS亲合法能够以高回收率分离MSC来源的细胞外囊泡，同时保持细胞外囊泡的高活性。换言之，它揭示了传统方法除回收率低外，还因超速离心的物理损伤引致细胞外囊泡的功能的损害。我们的PS亲和法有望成为未来细胞外囊泡疗法的创新技术。
◆结论
综上所述，尽管基于细胞外囊泡的疗法在再生医学领域正备受关注，但经典方法（例如超速离心）仍被广泛用于分离细胞外囊泡6）。PS亲和法是一种理想的方法，可解决传统方法带来的问题，例如回收效率低及降低细胞外囊泡的活性等。该试剂盒具有出色的回收效率、纯度、收集完整细胞外囊泡的能力及可重复性。不难设想，未来的再生医学将需要优化的细胞外囊泡分离方法，希望本文的PS亲和法将是实现这一目标的强大工具。
◆产品列表
产品编号 | 产品名称 | 规格 |
MagCapture™外泌体分离试剂盒PS | 2 tests | |
10 tests | ||
PS Capture™外泌体ELISA试剂盒（抗小鼠IgG POD） | 96 tests | |
PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（链霉亲和素HRP） | 96 tests |
◆视频
2020年ISEV研讨会：如何使用 MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS
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[用于分离和检测间充质干细胞来源的细胞外囊泡的PS亲和力的特性]。
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◆产品资料
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◆参考文献
1. Colombo et al., Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of Extracellular vesicles and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol, 30 : 255-289 （2014）. |
2. Mathieu et al., Specificities of secretion and uptake of Extracellular vesicles and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nat Cell Biol, 21（1） : 9-17 （2019） |
3. Phinney and Pittenger, Concise Review : MSC-Derived Extracellular vesicles for Cell-Free Therapy. Stem Cells, 35（4） : 851-858 （2017） |
4. Thery et al., Isolation and characterization of Extracellular vesicles from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol Chapter 3, Unit 3 22 （2006） |
5. Nakai et al., A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles. Sci Rep 6 : 33935 （2016） |
6. Fujita et al., Clinical Application of Mesenchymal Stem Cell-Derived Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Inflammatory Lung Diseases. J Clin Med 7（10） : 355 （2018） |
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