使用细胞融合试剂 GenomONE™-CF进行核移植的方法

本文介绍的实验方法，是利用灭活仙台病毒（HVJ Envelope：HVJ-E）将供体细胞与小鼠去核未受精卵融合，并进行核移植的方法。

◆实验操作流程

【实验前准备】

HVJ-E悬浮液的制备

将0.26 mL的HVJ Suspending Buffer添加至Freeze-dried HVJ-E 中，使用移液器进行悬浮。

将HVJ-E悬浮液分注为5 μL/tube并存放于-80°C下。冷冻的HVJ-E仅能融解一次。

细胞融合缓冲液（Cell Fusion Buffer）的制备

根据HVJ-E的用量，使用无菌纯水将细胞融合缓冲液（×20）稀释20倍。将稀释后的缓冲液冷藏储存。

【核移植流程（将卵丘细胞用作供体细胞时^注）】

Step 1：将存放在-80°C下的HVJ-E悬浮液在冰中融解（冻结储存至使用前）

Step 2：使用制备好的细胞融合缓冲液，根据供体细胞的类型， 对HVJ-E悬浮液进行稀释（使用时制备，稀释率见下文）

Step 3：如图1放置供体细胞、HVJ-E、受体去核未受精卵各一滴（室温）

在熟悉核移植操作前，一滴操作所加入的受体去核未受精卵数量少至5~10 μL，可以更有效地进行实验。

图1：操作方法的示意图

Step 4：使用微吸管从A液滴中吸出1个供体细胞

Step 5：从B液滴中吸出大约体积为供体细胞2~3倍的HVJ-E

Step 6：将供体细胞与HVJ-E以按压方式移植至 C液滴的去核未受精卵中（图 2）

Step 7：在37℃，5% CO₂的培养箱中，培养15～30 min（图3）

Step 8：确认融合情况（图4）

Step 9：移至活性化刺激用培养基（不含Ca²⁺、Mg^{2 +}，含锶和细胞松弛素B的KSOM培养基）中，培养5~6 h。

Step 9：确认原核形成后，移至KSOM培养基并培养到所需的发育阶段。

图片来源：东海大学医学部基础医学系分子生命科学 本杉奈美老师、木村穣老师

注：对于胚胎干细胞（ES细胞）的核移植情况：与卵丘细胞相同，进行Step 1~ Step 9的操作。

注意对于使用卵母细胞核和受精卵原核进行核置换的情况：在Step 9中移至KSOM培养基并培养到所需的发育阶段。

【结果】

小鼠核移植实验中HVJ-E的稀释率及其融合效率

※ HVJ-E悬浮液和缓冲液的稀释液均在使用时制备

※※ n≧200~300

数据来源：东海大学医学部基础医学系分子生命科学 本杉奈美老师、木村穣老师

◆什么是HVJ Envelope（HVJ-E）/ 灭活的仙台病毒？

HVJ Envelope（HVJ-E）是把仙台病毒（HVJ：Hemagglutinating virus of Japan）的基因组RNA完全灭活并纯化后，仅保留外膜蛋白（HN和F）膜融合活性的粒子。对人或实验动物已经失去了传染性或增殖性，因此无需任何特殊的操作或设备，即可在常规安全等级的实验室中使用。

Kaneda, Y., et al.: Hemagglutinating virus of Japan (HVJ) envelope vector as a versatile gene delivery system. Molecular Therapy, 6, 219-226 (2002)

◆GenomONE ™-CF 产品规格

※ 本页面产品仅供研究用，研究以外不可使用。

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