鲎试剂在新冠疫苗研发中的重要性

Lisa Komski，LAL事业部销售总经理

2019年12月，一场肺炎疫情爆发。2020年1月，人们明确引发这场疫情背后的病原体是一种被称为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）的新型冠状病毒。世界卫生组织（WHO）将这种疾病命名为coronavirus disease 2019（COVID-19）。自这些初步报告以来，COVID-19已迅速蔓延并成为全球流行病。截至2020年6月5日，据世界卫生组织（WHO）报告，全球因COVID-19导致的确诊感染6,535,354例和死亡患者387,155例^[1]。

全球实验室逐步将研究的工作重点放在研发COVID-19疫苗上，质量控制标准得以保持在整个研发过程中变得至关重要。本报告重点关注内毒素污染COVID-19疫苗研究带来的风险，并介绍鲎试剂（LAL）检测在疫苗研究和生产过程中对内毒素检测的效果。

◆革兰氏阴性菌、内毒素和败血症

革兰氏染色实验由Hans Christian Gram于1884年发明。该实验基于细菌细胞壁的肽聚糖层厚度来表征细菌。革兰氏阳性细菌具有非常厚的肽聚糖层，其范围在20~80 nm。而相比之下，革兰氏阴性菌的肽聚糖层则要薄得多，约为8 nm ^[2]。

革兰氏阴性菌是多种食源性疾病、霍乱、淋病和尿路感染等传染病的罪魁祸首。

革兰氏阴性菌的显著特征之一在于其产生内毒素的能力。内毒素，也称为脂多糖（LPS），是革兰氏阴性菌最外层膜的一种成分，由固定于细胞壁上的脂质基团和一个从细菌表面延伸的寡糖基团组成。其脂质部分，称为类脂A，是作为病原体相关分子模式（PAMP）被免疫系统识别的主要结构。具体来说，类脂A可以被Toll样受体4（TLR4）和MD-2这两种免疫系统蛋白复合物识别。当其被激活时，该复合物会触发先天免疫级联反应以对抗病原体^[3]。

内毒素是一种强效热原，可在皮摩尔级别的浓度下激活免疫细胞^[4]。由此产生的促炎细胞因子被释放至血液中，触发各种下游免疫反应，如白细胞的聚集和补体系统的激活等^[5]。通常这种免疫反应会清除感染而不会造成明显的额外损害。但在患败血症的情况下，过度活跃的免疫反应会对全身的健康组织造成损害，从而大大增加死亡风险。据报道，2005年~2015年间发达国家的脓毒症住院死亡率为17%，严重脓毒症住院死亡率为26%^[6]。

由内毒素引起的脓毒症也可能会发展为感染性休克，其特征是低血压和血清乳酸水平升高^[7]。感染性休克是由促炎细胞因子对组织因子（TF）的上调而引起的。TF能够启动导致凝血酶合成的级联反应。而凝血酶是一种促进血液凝固，防止过度出血的酶，在脓毒症中的激活会导致血液形成凝块，使血压突然下降^[8]。感染性休克甚至比脓毒症更危险，医院死亡估计率为39%^[9]。

◆使用鲎试剂检测内毒素污染

内毒素具有热稳定性高的特点。因此，许多常见的灭菌方法，如高压灭菌或干热灭菌等，即使在细菌被杀灭的情况下，也可能会残留有内毒素^[10]。因此，可靠的内毒素污染的检测已成为制药、生物技术和医疗保健行业的主要关注点。

目前，美国食品药品监督管理局（FDA）指南要求对所有医疗器械和药品进行内毒素检测。若医疗器械需要与心血管或淋巴系统接触，则其浸提液的内毒素含量（单位：EU）必须低于0.5 EU/mL（20 EU/device）；若与脑脊液接触，则必须低于0.06 EU/mL（2.15 EU/ device）^[11]。药品的限量计算公式为K/N，其中K表示热原阈值剂量，M表示药物的最大剂量。K的标准值详见下表^[12]。

对于内毒素检测，目前有几种不同的检测方法。1900年代初，首次使用家兔热原试验（RBT）进行内毒素检测。该方法向兔静脉注射待测溶液，并将体温升高作为检测潜在危险内毒素水平的基础。然而这种方法既昂贵又耗时，而且假阳性误报率相对较高，还引起了动物实验相关的伦理问题^[13]。

后来，鲎变形细胞裂解物（LAL）检测取代了RBT法，至今仍是行业的标准。该检测的活性成分来源于马蹄蟹（鲎科，Limulidae）。马蹄蟹的血淋巴（类似于血液的液体）含有被称为变形细胞的免疫细胞，这些免疫细胞会因暴露于内毒素而迅速凝结。在马蹄蟹中，这种级联机制被用于“隔离”或分离潜在的病原体并防止它们传播到体内的其他部位。

凝血级联反应中的关键参与因子为C因子、B因子和凝固酶原这三种丝氨酸蛋白酶原酶。当鲎试剂与内毒素接触后，C因子会自行切割，使自身激活。随后，C因子裂解并激活B因子，后者再裂解并激活凝固酶原。最后，活性凝血酶裂解另一种称为凝固原的蛋白。许多被裂解的凝固原分子随后聚集在一起并形成凝胶。这一反应高效，只需90秒即可形成凝胶^[14]。

LAL检测利用了这种化学级联。凝胶法是最早的LAL检测法，是一种通过可见凝胶的生成来确定阳性结果的定性检测法。凝胶法的检测范围小，一般限于0.01和0.03 EU/mL之间。随后开发出定量的LAL检测方法，比凝胶法更为灵敏。第一种定量法为显色法，主要利用Boc-Leu-Gly-Arg-对硝基苯胺进行检测。该分子的氨基酸序列与凝血酶在凝固素原上切割的位点相匹配。因此，当凝血酶激活时，它会切割 Boc-Leu-Gly-Arg 标签并释放出显色基团对硝基苯胺。然后，可以在405 nm处检测游离对硝基苯胺的吸光度。

FUJIFILM Wako提供的显色法鲎试剂（点击文字查看详情）具有高灵敏度，检测限值低的特点（0.0002到0.0005 EU/mL）^[13]。另一种定量法为浊度法。浊度是指水溶液由于悬浮固体的生成使透光率减少的值。在浊度法检测中，固体是指在凝胶反应过程中所形成的凝胶。利用溶液的浊度可计算内毒素浓度。FUJIFILM Wako的高灵敏浊度法鲎试剂（点击文字查看详情）的检测下限约为0.001 EU/mL^[13]。

◆疫苗研发和生产中的鲎试剂检测

疫苗与其他药品不同，不要求遵守FDA内毒素浓度的标准限值。因此，疫苗之间的内毒素水平可能存在很大的差异。根据第三方实验室的分析报告，各种疫苗内毒素的含量范围在无法检测到1,000,000 EU/mL之间。考虑到疫苗配方的复杂性，情况将更加复杂，从而难以推测致热反应是由内毒素引起的，还是由其他疫苗成分或污染物引起的^[15]。目前，FDA仅对多糖疫苗、狂犬病疫苗和蜱传脑炎疫苗要求进行内毒素检测，尽管其具体的内毒素限值仍未被RPT法确定下来^[16]。

虽然缺乏明确的FDA指导方针，但在整个疫苗生产过程中适当的内毒素监测对于检测超出安全水平的污染来说非常重要。由药品和疫苗中的内毒素污染引起的不良事件已被多次报道。其中一个案例，是由于抗生素庆大霉素引发的210例热原反应。后来发现该庆大霉素批次中，有10%的内毒素水平超过了5 EU/kg^[17，18]。在另一起案例中发现全细胞百日咳疫苗具有高免疫原性，在改用无细胞疫苗后免疫原性降低^[19]。据报道全细胞疫苗中的内毒素水平显著高于无细胞疫苗中的内毒素水平^[20]，因此，内毒素污染至少在某程度上会导致全细胞疫苗具有较高的免疫原性，尽管由于疫苗组分的复杂性，使得这一点难以确认^[15]。

Brito和Singh在2011年的评报中，为临床前疫苗研究的内毒素限值提供了非官方建议^[15]。这些限值是根据以往报告中不同类型疫苗的安全内毒素水平计算得出的。建议限值总结如下：

虽然早期的疫苗使用RBT进行内毒素污染测试，但现在许多现代疫苗用的是LAL法进行检测。据研究报道，LAL检测中的凝胶法对于检测乙型肝炎疫苗，与RBT法同等可靠、灵敏^[21]。另一项研究发现，LAL检测对39种不同猪疫苗的内毒素检测有效^[22]。目前，LAL检测已成功应用于甲型肝炎、乙型流感嗜血杆菌、流感、狂犬病、伤寒和黄热病的商业疫苗^[16]。

在考虑将LAL检测应用于疫苗质量控制时，首先测试疫苗制剂中组分对检测的干扰是十分重要的。如氢氧化铝，这种常见的疫苗添加剂可能会导致LAL检测出现假阳性结果^[23]。而通过稀释待测样品，或可以消除这种干扰并使LAL检测得以成功应用^[21]。如今，综合成本、灵敏度和准确度方面的考虑，LAL检测仍是大多数类型疫苗内毒素检测的理想选择，并且其还可与RPT或其他热原/内毒素检测方法结合使用。

◆总结

内毒素是一种强效热原，会引起败血症和感染性休克等致命的免疫反应。由于其热稳定性高，难以被大多数常见的灭菌技术灭活。若潜在的COVID-19疫苗中存在内毒素污染，则会诱发不良热原事件，极大地影响临床前或临床研究。LAL检测提供了一种快速且性价比高的检测方法，可确保产品内毒素水平低于建议限值。自1960年代初被研发以来，该检测方法已得到广泛验证和表征，目前仍是内毒素检测的主流选择。在疫苗研究和生产过程中多个检查点结合鲎试剂检测将大幅度降低不良事件出现的风险，并扩大其治疗窗口。

◆相关产品

浊度法/凝胶法鲎试剂

显色法鲎试剂

◆参考文献

LISA KOMSKI

Lisa Komski是FUJIFILM Wako Chemicals U.S.A. Corporation鲎试剂部门的销售总经理。在化学和生命科学行业拥有近30年的职业生涯，为美国食品和药物管理局（FDA）要求和cGMP方面的业务发展专业人士。Lisa 拥有生物学和医学技术学位。

Email：lisa.komski@fujifilm.com