球体·类器官共培养的范式转移

Ginreilab Inc. 岛崎猛夫

◆前言

细胞培养方法种类繁多，例如，在培养皿上培养细胞，并集中分析同种细胞的单层静置培养法；通过搅拌培养基使细胞保持在悬浮状态进行培养的悬浮培养法；使用凝胶状基质进行培养的培养法等等。这些培养技术犹存已久，1962年，Boyden等人开发了细胞迁移分析法^1），后被用于通过被称为细胞培养插件的培养基进行非接触式共培养法。1971年，立体培养细胞群开始有了“球体”^2）的说法。

球体是指细胞通过相互粘附形成的简单集合体，并构建成三维结构的状态。顾名思义，「球（sphere）+oid」即指球状物体。一般而言，细胞会通过支架粘附于容器，若没有支架，或支架较弱时，就会相互粘附形成三维立体的结构。球体培养制备正是利用这一特点，不制作支架的方法。例如，使用非粘附性容器的制备方法；通过工学的微细加工技术使用结构体的方法；一边旋转培养器一边进行培养的旋转培养法；在液滴中进行立体构建的悬滴法等等^3）。

关于进行共培养或球体培养的理由，若能让细胞与细胞间进行直接或是间接交流（相互作用），就能阐明细胞是否发挥了单个细胞无法发挥的功能。

球体与下述的类器官，虽然经常使用相同意思来表达，但球体的功能性并不如类器官发达，严格来说，两者间有着明显的区别。

类器官「器官（organ）+oid」，即指类似于器官的物体。一般而言，它指三维培养干细胞所得的组织。最近，由干细胞分化而成的不同种类的分化细胞，以及原分化细胞混合制备而成的立体细胞群也被称为类器官。因此，无论原始细胞是否皆为干细胞，均可广义地描述为“利用细胞技术人为制造与器官类似的组织”。生物学上类器官是指 “使用干细胞或有助于器官形成的前体细胞等，通过药物和环境构建等方法人为模拟胚胎学中的生物学过程，具有自律性形成的器官样集合体”。各项研究表明，类器官可详细再现人类器官的结构和生理功能，能够用于阐明病理和药物开发。为顺应临床测试周期的缩减以及动物实验替代的趋势，类器官的研究盛行。以生物学研究为基础，结合被称为organ-on-a-chip的工学技术进行培养和分析的研究盛行，总称为仿生系统（microphysiological systems：MPS）。美国环境部提出2025年将动物实验减少30%，2035年完全消除动物实验的计划。2023年1月6日，美国FDA颁布了临床试验前无需进行动物实验，可采用使用细胞技术实验结果的法案^4）。虽然颁布的法案与预期相符，但依然让人震惊。某种意义上，两者间的关系正如“动物实验=汽油车”，“细胞技术和类器官=电动车”。换言之，未来使用细胞技术的新药研究将会成为主流，球体培养、Organ-on-a-chip 、MPS技术则会成为范式转移的关键技术。

为使水平链接细胞共培养板UniWells^5）向Organ-on-a-chip/MPS系统进化，我们进行了开发。作为初级阶段的技术介绍，笔者将介绍水平方向连接的优点，以及运用其优点进行的球体和类器官的共培养。

1）UniWells水平方向连接的优点

作为共培养容器被广泛使用的插入式细胞培养板，原本是Boyden等人为了检测细胞移动能与浸润能而开发，被称为Boyden chamber^1）。其结构为两个桶状容器交叠，上侧的容器底面为滤膜。向下侧容器中的培养基中加入细胞引诱剂，并通过计数在滤膜上方培养的细胞穿透滤膜的孔移动到下方的细胞来检测浸润度。因为该容器可直接用于细胞共培养，后来也被长期使用。

       由于Boyden chamber是为了检测细胞的浸润以及移动能而开发，所以接种的细胞数量较少。细胞数量少的话，部分滤膜孔就不会被细胞堵塞，就可上下共用培养基。而细胞数多的话，就会堵塞滤膜孔，降低或停止共用培养基。然而，这一显而易见的事实并未受到太多关注，插入式细胞培养板仍成为了共培养的标准容器。并不是细胞数量少就无法共培养，但因为无法直接观察上侧容器中的细胞，所以一不留神细胞可能就会融合（细胞面积占有率高）。这时，就会在没有意识到这并不是共培养的情况下，进行结果分析。实际上，只要分析电子显微镜照片的结果就可进行确认（图1）。

图1. 滤膜部分的电子显微镜图像

在UniWells中，由于细胞与过滤孔的位置相隔较远，即使细胞数量多也不会堵塞过滤孔。

2）关于三维共培养

MPS的目标是模拟人体。人体的各个器官处在不同的位置，无需直接接触，通过血液与组织液进行信息以及物质的双向交换，或是单向作用。为了模拟这些，需要迷你器官之间不经过直接接触就能够进行物质交换和影响的构造，以及共培养和单向作用的构造。此外，由于MPS为实验，所以还需评估实验误差。换言之，需要将类器官间的共培养和单向培养、多个类器官同时评估技术纳入重要技术。

在MPS中，已开发大量采用微通道技术的系统，而UniWells™ 采用的滤膜，就是通道长度非常短的微通道集合体。另外，通过上述的滤膜位置关系，UniWells™ 具有不堵塞通道，进行细胞和球体/类器官培养的优势。为了进一步优化UniWells™，敝公司目前正致力于将其球体、类器官和MPS化。作为优化第一弹，于2023年发售可安装在UniWells™上使用的PDMS制适配器UniWells-Cups（暂定名）。该产品利用了微加工技术和PDMS制造技术，与住友理工株式会社共同开发的UniWells™ 任选产品。可使用UniWells™ 共培养多个球体或类器官，还能进行各种组织学的评估。众所周知，球体和类器官各不相同。该系统可以同时共培养多个球体和类器官，因此可以在相同的实验条件和染色条件下同时评估球体阵列。

图2. UniWells-Cups：Ginreilab Inc.和住友理工株式会社共同开发的产品

作为优化第二弹，预计今后将推出MPS设配器。

◆参考文献

1. Boyden, S. et al. : J. Exp. Med., 115 （3）, 453 （1962）.

2. Sutherland, R.M. et al. : J. Natl. Cancer. Inst., 46, 113 （1971）.

3. Jubelin, C. et al. : Cell. Biosci., 12, 155 （2022）.

4. The FDA Modernization Act 2.0. Available onlineより
4. （https://www.congress.gov/bill/117th-congress/senate-bill/5002 （2023年1月29日）.

5. Shimasaki, T. et al. : Micromachines （Basel）, 12 （11）, 1431 （2021）

◆产品列表

点击此处查看相关产品：水平连接细胞共培养板UniWells™