——与传统ROCK抑制剂Y-27632的比较——
和光纯药时报Vol.94 No.1(2026年1月)，日本爱知县医疗疗育综合中心 发育障碍研究所 基因医疗研究部 加藤君子 著
◆前言
自2006年山中伸弥博士等人建立人iPS细胞以来，该细胞已成为再生医疗以及疾病研究的核心研究工具。作为研究工具，iPS细胞具有以下优异特性：
伦理优势：与ES细胞不同，无需使用受精卵，可由体细胞制备，因此涉及的伦理争议少。
构建患者特异性模型：可直接使用患者来源体细胞制备，构建保持个人遗传背景的疾病模型。同时，还可用于未明确致病基因的疾病研究。
无限增殖能力与多能性：维持自我复制能力的同时，还能分化为三胚层的所有细胞种类。此外，近年来通过诱导形成原始态iPS细胞、8细胞期胚胎样细胞及胎盘前体细胞，并构建三维人胚胎模型（类囊胚）等技术，已能再现人发育早期的各个阶段。
与基因组编辑的高亲和性：可从单细胞制备克隆，适用于制备均一性基因修饰细胞株。
应用于药物筛选：具有制备大量相同遗传背景细胞的潜能。
特别是结合CRISPR-Cas9 等基因编辑技术，并通过导入或修复疾病相关突变，使精准疾病建模以及基因功能分析已取得了突破性进展。然而，电穿孔作为高效的基因导入方法，因其需要大量细胞（≥10⁶个细胞），且 iPS 细胞的培养成本高昂，已成为研究中的重大负担。
为攻克这一问题，少量细胞即可实现（10⁴–10⁵个细胞）的微量电穿孔技术被寄予厚望。然而，随着细胞数量的减少细胞死亡率显著上升，这已成为新的技术瓶颈。iPS 细胞在单细胞解离过程中极其脆弱，使用传统的ROCK 抑制剂 Y-27632，在微量体系电穿孔的实验条件下往往难以提供充分的保护效果。
本研究选用可有效抑制细胞凋亡的抑制剂 CEPT Cocktail1，2）（Chroman 1、Emricasan、Polyamine supplement、Trans-ISRIB），验证了其在微量电穿孔中提高人iPS细胞存活率的效果。与传统Y-27632相比，CEPT展现了优异的细胞死亡抑制效果。
| 方法 | 优点 | 缺点 |
| 常规电穿孔 | 基因导入效率较高 | 需要大量iPS细胞 培养、试剂成本高昂 处理后的细胞死亡风险 |
| 微量电穿孔 | 少量细胞即可操作 降低成本 | 细胞死亡率显著提升 克隆获得率下降 |
| 脂质体转染 | 少量细胞即可操作 细胞的负担小 | iPS细胞的导入效率低 |
表1.各类基因导入方法的优缺点
◆微量电穿孔面临的问题与解决方法
将基因组编辑用质粒或核糖核蛋白复合体（RNP）导入人 iPS 细胞的方法各有优缺点，如表1 所示。
微量电穿孔的核心问题是，伴随细胞数减少的细胞存活率的急剧下降。这是由于电刺激直接损伤细胞膜，且iPS 细胞特有的细胞间相互作用（如，通过E-钙黏蛋白（CDH1）的细胞黏附等）的减弱也会诱导细胞凋亡3）。为此，与Y-27632相比，CEPT Cocktail能同时抑制多条细胞凋亡通路，发挥更好的保护效果。
细胞与试剂
● 人 iPS 细胞株：201B7（通过导入山中因子建立的细胞株）
● 培养基：AK02N（Ajinomoto，日本味之素）
● 细胞凋亡抑制剂：CEPT Cocktail（富士胶片和光纯药），和 Y-27632（ROCK抑制剂，对照组）
电穿孔参数
● 设备：NEPA21（NepaGene ）
● 细胞量：5×10⁴–1×10⁵个 / 样本（小规格条件）
● 导入基因 / 蛋白：4 μg Cas9 （NIPPON GENE）、1 μg gRNA（crRNA+ATTO550 tracrRNA，IDT）、1 μg HDR 质粒
● 脉冲参数（见表 2）
| 电压（V） | 脉冲时长（ms） | 脉冲间隔（ms） | 脉冲次数 | 衰减率（％） | 极性切换 | |
| 穿孔脉冲 | 125 | 5 | 50 | 2 | 40 | ＋ |
| 转移脉冲 | 20 | 50 | 50 | 5 | 50 | ± |
表2. 电穿孔参数
评估方法
细胞占有率评估法：为定量细胞占有率，采用局部对比度差分法进行图像分析。该方法通过计算局部背景的差分，将超过特定阈值的区域判定为细胞，并根据样本特性优化参数，并对检测结果进行可视化验证。
结果
CEPT 与 Y-27632 在细胞存活促进效应的比较
用细胞占有率进行存活率评估的结果显示，CEPT 处理组的细胞存活率显著高于Y-27632 处理组（图 1）。
以 Y-27632 处理组的存活率为基准（100%），CEPT 处理组的相对存活率为 155.76±1.31%，细胞保护效果约为 Y-27632 的 1.56 倍（p < 0.001，Welch t 检验）。此外，ATTO550 阳性细胞的比例在两组间无显著差异（数据未显示），表明使用 CEPT对基因导入过程无不良影响。
图1. CEPT与Y-27632在抑制细胞死亡的对比，在CEPT存在下，电穿孔后 24 小时后的细胞存活率大幅上升。
结论
本研究表明，富士胶片和光纯药的 CEPT 相比 Y-27632 具有更优异的细胞死亡抑制效果。通过使用 CEPT ，可显著缓解微量电穿孔中的细胞死亡问题。
◆结语
近年来，多项研究陆续发现，使用 CEPT Cocktail可提高原始态多能干细胞的类囊胚形成效率（Yu et al., 2023, PMID : 37683605 ; Chen et al., 2025, PMID : 40961945 ; Pinzon-Arteaga et al., 2024, PMID : 39453814 ; Xie et al., 2025, PMID : 39814012）。
尽管我们未观察到CEPT Cocktail对始发态（Prime-type）iPS 细胞重编程为原始态（Naive-type） iPS 细胞的促进作用（未发表数据），但在使用原始态 iPS 细胞制备类囊胚时，我们依然建议使用CEPT Cocktail。
◆参考文献
1. Chen, Y. et al. : Nat. Methods, 18 （5）, 528 （2021）.
2. FUJIFILM Wako，CultureSure™ CEPT Cocktail（1,000x）
3. Higo, S. et al. : Methods Mol. Biol., 2320, 235 （2021）.
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