【综述】再生医疗领域如何选择快速无菌检测法及相关问题

和光纯药时报 Vol.94 No.1（2026年1月）， 地方独立行政法人大阪府立医院机构 大阪羽曳野医疗中心 新一代创药创生中心 松山晃文著

1. 前言

在日本《再生医学安全法》的监管下，目前已有因接受再生医疗而引发败血症的案例。这可能是由于未进行适当的样品保存，且没有做好无菌控制导致的。因此，本文将重点讨论如何在药物注射给患者之前，通过快速无菌试验来确保患者安全。首先，确保无菌性的关键在于微生物检测，我们将根据原理对其进行分类，并比较各种（微生物）检测法的特点以及检测范围。然后，将讨论快速无菌检测法的选择思路，最后阐述细胞加工制品的快速无菌检测中未解决的技术难题。

2. 微生物检测法的分类与应用

细菌检测法可分为直接依赖细胞增殖活性的增殖依赖性检测法，和非增殖依赖性检测法。由于非增殖依赖性检测法可以快速获取检测结果，常被用作快速无菌检测。根据检测原理，可将其进一步分为直接检测内源性荧光物质的方法，以及添加荧光物质（或可被微生物转化为荧光物质的基质）的方法。

增殖依赖性检测法是检测增殖过程中产生的二氧化碳、乙酸和乙醇等小分子化合物之类的化学副产物的方法。

非增殖依赖性检测法包括拉曼光谱法、检测菌体表面散射光的米氏散射法、特异性检测微生物DNA的核酸检测法，以及检测微生物特异性内源性非荧光物质的方法。

表1《微生物检测方法分类》从微生物检测方法和原理出发，整理了各类增殖依赖性和非增殖依赖性的微生物检测法 。

表1.微生物检测法的分类

3. 快速无菌检测法的现状

3.1 核酸扩增法

该方法的原理是以细菌特有的基因序列为标靶，进行核酸扩增并检测。通常是检测细菌DNA中细菌特有的的16S或23S rRNA的DNA序列（即核酸rDNA序列）。据称，每个细菌约有100个rDNA拷贝，与比其他微生物检测法相比，该方法在灵敏度、速度以及操作简易度上都更优异。然而，死菌rDNA的混入会导致假阳性问题。由于RNA易分解，过去一直认为rRNA检测难以应用，但目前已有市售的可检测rRNA的无菌检测产品（即RiboNAT™）。该产品降低了死菌rDNA导致的假阳性，操作简单的同时，还能确保检测灵敏度和特异性。

3.2 流式细胞术（FCM）

该方法的原理是，对液体中悬浮的活菌染色，并在液相中检测。由于该方法直接对细菌数进行计数，无需微生物增殖，因此能实现快速检测。目前常规FCM法的检测灵敏度约为100~1,000 cfu/mL，所以若不是培养后的样品则难以用于无菌检测。如果能开发出灵敏度小于1 cfu/mL的FCM法/技术，则其在再生医疗领域的应用未来可期。目前大多数FCM设备的检测阈值都是0.5 μm，无法检测如铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等小细菌（直径约0.35 μm）。此外，还需注意细菌染色剂的非特异性问题。

3.3 生物发光法和荧光法

该方法不受抗生素影响，适用于全菌种，但会因为细胞等杂质干扰而导致假阳性。检测只需数秒至数分钟，因其主要用于检测于气体中的活菌，所以被广泛用于无菌操作室的实时监测，目前市面上还有能检测细菌的同时鉴定菌种的仪器。环境中的细菌受低温、营养匮乏或药物影响，大部分处于VBNC状态（viable but non-culturable，可存活但非可培养状态）。事实上，它的细菌检出数量往往比使用培养基的空气采样法更高。由于VBNC细菌也呈阳性，所以与培养基法的结果缺乏一致性。

3.4 固相细胞计数法（SPC）

该方法的原理是使用过滤器捕获液体中混杂的细菌，并通过活菌染色实现可视化计数。因无需培养，数小时即可获得结果，这对于无法彻底灭菌后出厂的再生医疗制品具有重要的应用价值。该方法还可以排除增殖抑制物质的干扰，可以实现菌数测定和无菌测试的快速检测，兼具定量与定性分析能力。然而，要注意过滤器可能会堵塞，以及大部分细菌染色剂对细胞/细胞外囊泡有染色性。

3.5 气体测定法

该方法的原理是通过检测活菌培养时排放的CO₂等气体的增加速率，实现细菌增殖的检测。由于检测需 3 天以上，因此作为快速检测法的适用性受限。尽管操作流程简单，但当预计样品中存在抗生物质时，推荐使用含抗生素吸附磁珠的反应瓶。

3.6 薄膜过滤法（微菌落）

样品过滤后，将滤膜放入培养基专用培养盒，培养后进行染色和检测。该方法最初为制药用水的无菌检测而设计，因此仅适用于需氧培养。将该无菌检测法应用于再生医疗领域的无菌检测时表现出高灵敏度，检测值≤10 cfu/100mL。

3.7 阻抗法

通过检测细菌增殖过程中的阻抗（电阻）变化，检测存活且可培养的微生物。由于阻抗随样品组成而异，需提前绘制各个样品的标准曲线。在用于菌数检测（定量）用时，由于需制备标准曲线，操作较为繁琐。

3.8 脂肪酸分析法

从培养后的菌落中提取脂质，并使用GC-MS进行检测，将检测结果与数据库进行比对以鉴定菌种。该方法的前处理步骤非常繁琐，且所需受试菌量的样本量达mg级，因此无法有效用于菌落计数和无菌检测。

3.9 红外吸收光谱测定法

以培养后的菌落作为受试样品，使用异物分析用傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）进行非破坏性检测。但目前尚无用于细菌快速检测的市售仪器。

3.10 免疫学检测法

该方法基于荧光检测，可实现快速检测，尽管可忽略杂质的干扰，但从定量定性的角度出发，无法应用于菌落计数及无菌检测。但是，该方法非常适用于从复杂菌群中检测出特定菌种。

3.11 质谱法

本方法以培养后的菌落为受试样品，可快速完成检测。使用胰蛋白酶处理菌落后，采用TOF-MS进行蛋白质谱分析，再通过数据库比对鉴定菌落的菌种。该方法操作简便，且成本较低，但检测仪器价格高昂。所以该方法难以用于无菌检测，也基本无法实现细菌计数；但是若用于菌种鉴定，其可靠性较高。

4. 关于快速无菌检测法的选择

适当的无菌检测法取决于无菌检测的样本种类，例如细胞种类、细胞悬液和细胞清洗液，因此检测前需进行讨论（表2）。例如， 富血小板血浆（PRP）不仅含有血小板，还含有大量中性粒细胞。即使将细菌输入PRP，受中性粒细胞的吞噬作用影响，菌落形成单位（CFU）也会随时间逐渐下降。此外，由于 PRP 未经培养等处理，细菌污染与增殖风险较低，尤其使用经认证的医疗设备采集的 PRP或许不需要无菌检测。另一方面，有报告显示，第三类再生医疗等提供计划的血液来源细胞及第二类（自体）间充质干细胞，存在因特定细胞制品引发败血症的病例，因此不仅需在前期讨论（在日本需经认证再生医疗等委员会的审查）阶段进行充分评估，还必须在细胞制品输注前确认其无菌性。鉴于市面上已有符合技术标准的无菌检测技术，可在输注前提供无菌检测结果，所以不进行无菌检测的决定在伦理上缺乏合理性。

为快速、经济、便捷地保障无菌性，选择核酸扩增法（3.1）、FCM（3.2）、生物发光法和荧光法（3.3）、固相细胞计数法（3.4）中的任意一种，或是组合上述的方法是较为现实地选择。FCM与生物发光法和荧光法面临的问题在于如何实现目标和非目标细胞（未来还将包括细胞外囊泡）与细菌的有效分离；核酸扩增法则存在死菌rDNA等的非特异性扩增问题。一般来说，检测的快速性与灵敏度、特异性之间往往需要权衡，而通过组合上述技术原理，有望将快速性与灵敏度、特异性同步提升至良好水平。

此外，给药路径和给药部位的选择也非常重要，尤其是向中枢神经系统或与其相连的视网膜给药时确保无菌性非常关键。笔者期望认证再生医疗委员会能针对此问题进行深入探讨。

5. 快速无菌检测法使用中相关的技术问题

参考药品GMP标准，需要抽取成品的10%~30%开展质量检测，并依据药典方法确保其无菌性。尽管细胞制品难以完全遵循GMP要求，但在未能确保无菌性的情况下进行给药是违背伦理且无法接受的。因此，采用符合药典同等要求的无菌性的快速无菌检测法已获得认可。在欧洲药典中，由于自体来源细胞制品的珍贵性，业界也在探索对最终培养废液以及细胞清洗废液进行无菌测试。然而，这通常需要对数十毫升甚至升（L）级别的废液样本进行检测，而前文所述的各种快速检测法往往仅适用于数百微升至 1 毫升左右的微量样本, 这是目前的局限所在。未来，亟待开发能够实现大体积样本浓缩，以及从样本中高效富集回收细菌性微生物的相关技术。

6. 结语

上述各类微生物检测法的选择，需要根据生产或出货管理的目的而定。核酸扩增法以及生物发光法和荧光法（包括FCM）发展迅速，若能与相关设备同步开发并完成方法验证，这种方法会成为与固相细胞计数法以及气体检测法相媲美的快速微生物检测技术。应用合适的快速无菌检测法，将为再生医疗提供强有力的安全保障。我们期望，只有经无菌性验证的细胞制品方能 应用于临床患者。

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