RiboNAT™ 快速无菌检测试剂盒
在注射用药的安全性检测中，多国药典规定的无菌检测法至少需培养14天。然而，某些细胞治疗必须在生产后的几天内输注给患者，这使得在给药前完成无菌检测变得困难，这也导致了对能更快提供结果的无菌检测方法的需求日益增长，以提升患者安全性。
RiboNAT™ 是一款采用核酸扩增检测（NAT）技术的快速无菌检测试剂盒，能够在短短7 小时内完成检测，与传统方法相比大幅缩短了检测时间。与传统NAT检测只针对微生物的基因组DNA不同，RiboNAT™检测的是核糖体RNA（rRNA）。由于rRNA在微生物中含量较高，这使检测更加灵敏。同时，传统方法容易因死菌残留DNA或环境及材料中的污染DNA导致假阳性，而RiboNAT™ 有效减少了这一问题，提高了检测的准确性。
◆特点
● 检测当日即可获取结果（约7 小时）
● 使用rRNA实时逆转录PCR法（RT-rt PCR）检测，灵敏度（9 CFU/mL）高于gDNA检测
● 降低死菌和残留DNA导致的假阳性
● 单次可同时检测多种细菌（需氧和厌氧）和真菌
◆实验流程
◆检测试剂盒规格
原理 | 使用荧光探针的One step实时逆转录PCR法 |
灵敏度 | 100 RNA copies/reaction |
引物/探针序列覆盖率* | 细菌：25,748种（95.7%）； |
目标序列 | 细菌：23S Ribosomal RNA（检测波长：515-530 nm） 真菌：25/28S Ribosomal RNA（检测波长：675-690 nm） Internal Control（内标）：合成序列（检测波长：560-580 nm） |
◆试剂盒组成
■ RNA Isolation Kit 1 （RNA分离提取试剂盒1） | ■ RNA Isolation Kit 2 （RNA分离提取试剂盒2） | ■ Detection Kit （RNA检测提取试剂盒） |
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① 酶促增强剂 ② 活化剂1（SCDM） ③ 活化剂2（TG）×2 ④ 核酸灭活剂 ⑤ DNase溶液 ⑥ 1st-DNase缓冲液（1） ⑦ 2nd-DNase缓冲液（2） ⑧ 蛋白酶K溶液 ⑨ 酶混合液 | ① 结合缓冲液 ② 1st-清洗缓冲液（1） ③ 2nd-清洗缓冲液（2） ④ 裂解缓冲液 ⑤ 裂解增强剂 ⑥ 洗脱缓冲液 ×3 ⑦ 磁珠 ⑧ 样品管 ×2 ⑨ 洗脱管 | ① 水 ② 阳性对照 RNA ③ 内标 RNA ④ 检测混合液 ×2 |
◆灵敏度检测
图1. 检测灵敏度
针对药典规定的六种微生物，制备了浓度为9 CFU/mL的微生物悬液。利用RiboNAT™从这些悬液中提取RNA，并检测核糖体RNA（rRNA）。所有微生物的rRNA均成功检出，Ct值均低于35。
检测灵敏度达9 CFU/mL |
图2. 细胞悬液样品中的检测灵敏度
针对药典规定的六种微生物，制备了浓度为9 CFU/mL的微生物悬液，并分别与0.25×106 cells/mL的HEK293细胞混合。利用RiboNAT™从混合悬液中提取RNA，并检测rRNA。所有微生物的rRNA均成功检出，Ct值均低于35。
此外，所有6种菌株在以下条件下也均被检出（数据未显示）：
· 间充质干细胞（MSC）：0.5×106 cells/mL
· T-cell：1.0×106 cells/mL
细胞悬液样品中的检测灵敏度达9 CFU/mL |
◆灵敏度更高的检测法
■ 菌浓度：2 CFU/mL ■ 孵育时间：3~15 h |
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图3. 灵敏度更高的检测方法
针对巴西曲霉（Aspergillus brasiliensis）、产孢梭菌（Clostridium sporogenes）和痤疮丙酸杆菌（Cutibacterium acnes），制备了浓度为2 CFU的微生物悬液。虽然RiboNAT™常规操作流程规定的孵育时间为3 小时，但该实验将孵育时间延迟至3-15 小时。孵育结束后，使用RiboNAT™提取RNA，并检测rRNA。结果显示，包括严格厌氧菌（产孢梭菌）和生长缓慢的细菌（痤疮丙酸杆菌）在内的三种菌株，在14小时或更长时间孵育后均成功检出，Ct值均低于35。
经14小时孵育，检测灵敏度可达2 CFU/mL |
◆降低假阳性
RiboNAT™ 包含死菌DNA灭活试剂以及DNase处理步骤，可有效降低样品中残留DNA导致的假阳性风险。
图4. 降低假阳性
使用商业化的无菌PBS作为测试样品，进行细菌核酸检测（NAT）。其中一组实验（上图），使用市售试剂盒提取DNA，随后进行细菌靶向实时荧光定量PCR检测。另一组实验（下图），使用RiboNAT™提取RNA，随后进行实时逆转录荧光定量PCR检测。基于DNA的方法中观察到六条扩增曲线，而使用RiboNAT™未检测到任何扩增信号。
RiboNAT™ 可以降低残留DNA导致的假阳性 |
FAQ
Q1：测试所需的样品体积是多少？
根据标准流程，总共需要2 mL样品进行离心后用于检测。虽然也可使用更小体积的样品进行检测，但微生物数量减少，检测到微生物的可能性会降低。
Q2：一套试剂盒可以检测多少个样品？
每个样品需进行一次RNA提取，每次进行双孔PCR检测（n=2）。除样品外，每次检测还需以下对照：阴性提取对照（1次提取→2 PCR孔）、无模板对照（4 PCR孔）和PCR阳性对照（4 PCR孔）。
RNA提取试剂盒支持50次提取，检测试剂盒支持100 PCR孔反应。
Q3：试剂需要一次性全部使用吗？
不需要。使用后请按使用说明于适宜温度保存，并在有效期内使用完毕。
Q4：兼容哪些实时PCR仪器？
已验证兼容 CFX96系统（Bio-Rad Laboratories公司）和的QuantStudio® 5实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific公司）。其他能够检测指定波长的实时PCR仪器也可能适用。
| 产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 | 备注 |
| 291-98401 | RiboNAT™ Rapid Sterility Test - RNA Isolation Kit 1 |
50 Tests | 微生物检测用 | 储存温度：-20°C |
| 297-98001 | RiboNAT™ Rapid Sterility Test - RNA Isolation Kit 2 | 50 Tests | 微生物检测用 | 储存温度：室温 |
| 293-98101 | RiboNAT™ Rapid Sterility Test - Detection Kit | 100 Tests | 微生物检测用 | 储存温度：-20°C |
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