生命科学论文综述——第一回 细胞外囊泡-基于PS亲和法的论文及其背后的故事-

本文由富士胶片和光纯药 生物制品推进部 寅嶋崇 攥写

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本专栏旨在以第三方视角，梳理和分析全球研究人员及企业使用FUJIFILM Wako产品的应用场景，以及基于实际应用的科研成果。

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细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EV）是由脂质双分子层包裹的囊泡，直径约 100 μm。自1946 年Chargaff 等学者揭示其存在以来，迄今已逾 80 年。EV作为细胞源性的信号传递分子备受关注，其内部不仅含有蛋白质，还包含核酸（DNA、RNA）、脂质、糖链及代谢物，可助力探索包括癌症在内的多种人类疾病标志物（生物标志物）。自发现EV以来，研究核心均围绕阐明其结构与特性展开，但是EV的定义仍不明确，至今依旧存在着多种纯化方法，且不同方法获得的EV特征不一。

作为本专栏的第一回，我们将聚焦于与 EV 携手前行的富士胶片和光纯药（FUJIFILM Wako），及其 EV 分离纯化试剂盒 MagCapture™ Exosome Isolation Kit Ver.2，揭开其背后的精彩故事。本文将分析业内具有代表性的论文，重点介绍 EV 的纯化方法，以及FUJIFILM Wako试剂盒的特征和魅力。

MagCapture™ Exosome Isolation Kit Ver.2

正如开篇所述，在多种EV纯化方法并存的情况下，研究人员通常会思考“究竟哪种纯化方法最为优越？“。基于相同的出发点，有的研究验证并比较了多种纯化方法，展示了各自优势的实验证据。接下来，将为大家介绍这篇论文。

Patil 等人 ^¹）的研究专注于 EV纯化方法，颇具价值。研究人员对目前常见的 9 种 EV 纯化方法进行了系统性的验证及全面评估，评估指标包括粒径均一性、纯度以及蛋白质组学分析结果，同时基于离心分离、粒径尺寸、沉淀、静电相互作用和亲和法五类纯化原理进行分析。

结果显示，即使是基于相同纯化原理的方法所获得的EV性能也存在差异。超速离心法（UC）和密度梯度离心法（DGUC）均需依赖超速离心设备进行操作，其中DGUC法因需制备密度梯度层，存在操作难度大，处理通量低且耗时长的问题。数据显示UC法富集的 EV 回收率虽高，但纯度稍低；DGUC法富集的EV纯度很高，但回收率低。尺寸排阻色谱法（SEC）与聚合物沉淀法无需专用实验设备，操作简便，特点是富集的EV 回收率高，但纯度稍低。而基于静电相互作用的纯化方法，以及亲和法之一的PS 亲和法（MagCapture™ Exosome Isolation Kit Ver.2）在所有评估指标上均表现优异，作为EV富集法效果显著。该方法尤其适用于少量血浆样本的高通量处理，以及生物标志物的发现研究。

关于利用EV探索中枢神经系统与癌症生物标志物的研究，本文将分别介绍以突触核蛋白病、膀胱癌为研究对象的相关论文。

在中枢神经系统领域，Miki 等人^2）的研究阐述了异常 α- 突触核蛋白（α-Syn）在多系统萎缩（MSA）中导致EV释放受损的机制。通过MSA模型小鼠的转录组实验，筛选出10种可能与 α- Syn存在相互作用的囊泡转运相关蛋白，包括突触结合蛋白 13（SYT13）。结果显示，其中 SYT13是唯一同时整合入分别与MSA和路易体痴呆（DLB）密切相关的胶质细胞胞浆包涵体及路易小体的蛋白。值得关注的是，SYT13与磷酸化 α- Syn的结合能力强于内源性α- Syn，且还能与SYT1及可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）结合形成复合物。

通过神经退行性疾病研究模型中常用的“SH-SY5Y细胞”进行的实验表明，SYT13 通过与 SYT1 及 SNARE相互作用，会抑制EV的释放量，这一现象与MSA和DLB中 EV 释放减少的病理特征相吻合。

这一系列实验所得的EV 相关证据，均使用FUJIFILM Wako的可特异性纯化磷脂酰丝氨酸 (PS)阳性EV的试剂盒（MagCapture™ Exosome Isolation Kit Ver.2），并通过CD9、CD81、CD63等已知的EV标志物进行定量分析，证实SYT13 与MSA及DLB密切相关。

在肿瘤研究领域，Tomiyama 等人3）的研究尝试通过EV探索膀胱癌标志物。该研究以膀胱癌患者尿液来源的 EV 为样本，通过鸟枪法蛋白质组学技术（采用串联质谱标签 [TMT] 联合液相色谱 - 串联质谱 [LC-MS/MS] 技术）鉴定出 1960 种标志物候选蛋白，并从中进一步筛选出 17 种细胞质来源的EV蛋白。

在病例-对照研究中，对每组近50例的 EV 样本进行靶向蛋白质组学（选择反应监测/多反应监测，SRM/ MRM）分析，最终筛选出10 个在膀胱癌中明显高表达的靶点。最终，EIF2S1被选为诊断性能最佳的靶向标志物，在膀胱癌细胞株（T24 和 5637）中敲低EIF2S1，可显著抑制细胞增殖。细胞株的EV纯化使用FUJIFILM Wako的试剂盒（MagCapture™ Exosome Isolation Kit Ver.2） ，并提前确认了EIF2S1 的表达。基于相似的研究方案，FUJIFILM Wako的外泌体提取试剂盒有望广泛应用于肿瘤标志物的筛选研究。

最后，介绍一篇探讨使用EV进行分析时样本处理方法的论文。器官、组织及细胞分泌的 EV 会随血液循环至外周部位，基于此，有研究尝试使用少量外周血或尿液等低侵入性样本，进一步开展蛋白质组学及RNA 分析。村冈等人^4）使用FUJIFILM Wako的试剂盒（MagCapture™ Exosome Isolation Kit Ver.2）从血浆、血清这类外周样本中纯化EV，成功鉴定出 4,079 种EV特异性蛋白，还从血液样本中进一步鉴定出健康人群来源的EV 中普遍存在的组织特异性蛋白群。为从此类实验中获取可靠证据，通常需处理高通量的微量样本。村冈等人^5）将这一技术难点列为研究重点，指出能处理磁性颗粒的自动化实验设备（AutoPure-Mini、Maxwell^®、KingFisher™），采用多孔板可实现对高通量微量临床样本中的EV进行自动化处理，从而实现高效的蛋白质组学分析。这种自动化蛋白质组学用的 EV 样本制备法，可有效用于大规模生物标志物的开发、验证，以及常规检测的样本处理。FUJIFILM Wako基于 PS 亲和法研发的试剂盒（MagCapture™ Exosome Isolation Kit Ver.2）也有望在该领域的相关研究与应用中发挥重要作用。

自动提取设备Auto-Pure Mini

◆参考文献

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