生命科学论文综述——第二回 小分子化合物

-优质的未分化维持、分化诱导试剂助力干细胞研究- 

本文由富士胶片和光纯药 生物制品推进部 木上椋介 攥写 

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本专栏旨在以第三方视角，梳理和分析全球研究人员及企业使用FUJIFILM Wako产品的应用场景，以及基于实际应用的科研成果。

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诱导多能干细胞（iPS细胞）问世至今已满20年，它由京都大学山中教授研发，被视作是因伦理问题而难以广泛应用的胚胎干细胞（ES细胞）的替代方案。iPS细胞诞生之初曾一度被视为ES细胞的下位替代品，但其核心是由体细胞去分化而来，因此自体细胞和异体细胞均可作为来源。由于该特性能够规避遗体移植过程令人担忧的“免疫原性”问题，从而确立了iPS细胞有别于ES细胞的独特优势。

构建 iPS 细胞需要将四种特定基因（即“山中4因子”）导入体细胞。最初，病毒载体因优异的基因导入效率成为首选工具，包括在研究领域长期使用的逆转录病毒和慢病毒等病毒来源载体，但它们具有在宿主细胞基因组中引起插入位点突变的特性，因此人们担心建立的iPS细胞存在癌变风险。此后，为了避免这一问题，研究人员开发了非病毒载体类型的基因导入方法，以及不进行基因导入、仅使用小分子化合物实现细胞重编程的方法，持续推进降低iPS细胞的癌变风险。

从体细胞建立iPS细胞后，细胞的维持和分化诱导需要小分子化合物和细胞因子等生长因子。小分子化合物和细胞因子均被广泛应用于基础研究和临床应用的各个领域。其中，小分子化合物因采用化学合成法制备，动物源成分所致的污染风险低、批间差小，可获得稳定的培养结果。

2026年，在iPS细胞发明国日本，全球首款使用iPS细胞的治疗产品获批。从该技术诞生至今的漫长岁月证明，这条道路并非一帆风顺。发明之初，几乎所有人都曾怀揣利用iPS细胞实现“再生医疗”的美好愿景。然而，由于安全性为绝对前提的再生医疗审批极其严苛，iPS细胞制剂的开发方向暂时进行了调整，即作为动物试验替代方案用于“药效评价”、“毒理评价”等领域。其定位介于常规的细胞检测和动物试验之间，但又并非完全是动物试验的下位替换。这是由于动物试验毕竟是在动物体内进行评估，而iPS细胞源于人细胞，即便是in vitro检测，也能实现针对人源细胞的评价。从这一角度出发，iPS细胞因可避免反复采集人体活检样本用于药物评价的高侵入性试验而极具优势。在药物研发过程，属于首次人体试验（First-in-human，FIH）的I期临床试验门槛依然极高，而能够率先实现FIH的iPS细胞，无疑为全球药物研发注入了强劲动力，推动其快速发展。实际上，利用iPS细胞的药物评价体系正稳步迈向实用化，类器官和微生理系统（MPS）的诞生便是其中的典型代表。iPS细胞自发现以来，经过在这些领域深耕厚植的积累，终于在2026年时机成熟之际，正式拉开了再生医疗应用的序幕。

本专栏将介绍再生医疗和iPS细胞领域的五篇论文。虽然都是iPS细胞研究，但其领域和研究对象各不相同。希望通过本专栏，能够为您传递前沿的学术新知。此外，本文还收录了实验中使用的小分子化合物的相关信息。

【iPS细胞的悬浮培养】

人iPS细胞具有在悬浮培养中自分化的特性，因此，通常在贴壁培养和单层培养条件下进行培养。若能实现iPS细胞的悬浮培养，就能大幅降低培养相关的成本和工作量，因此建立一套成熟的培养方案一直备受期待。

Takasaki等人^1）发现，iPS细胞在悬浮条件下培养出现的突发性分化与Wnt信号和PKCβ信号通路相关。通过在培养基中添加这两条信号通路的抑制剂IWR-1-endo和LY333531，成功抑制了人iPS细胞在悬浮培养时的自分化。基于这一结果，他们在添加上述两种化合物的悬浮培养体系中，实现了保持自我复制能力的超10次传代的长期培养、培养细胞的直接冻存及复苏，以及在320 mL容量生物反应器中的大规模培养。

(论文中使用的小分子化合物，FUJIFILM Wako可提供：Y-27632、IWR-1-endo、DMH1、SB43154、CHIR99021、A-83-01、Dorsomorphin、Purmorphamine)

【多巴胺神经前体细胞的诱导和筛选】

帕金森病（PD）以多巴胺（DA）神经细胞的丢失为病理特征，会导致运动迟缓、肌强直及静止性震颤等运动症状。DA神经前体细胞移植是极具潜力的PD治疗策略之一，基于iPS细胞的相关研究也已广泛开展。然而，既往研究提示，分化细胞中残留的未分化干细胞等可能会引发肿瘤形成，同时混入的血清素神经元也可能会导致移植诱发性异动症^※。为避免上述不良后果，需从供体细胞群中高精度地去除不需要的细胞。

※ 异动症（Dyskinesia）：指口、舌、手足等部位出现违背自身意志的不自主运动。

Doi等人^2）利用在大脑中表达的蛋白CORIN，成功筛选并纯化了由人iPS细胞分化的DA神经前体细胞。研究团队首先通过添加CHIR99021等方式改良了现有的神经细胞分化方案，将iPS细胞定向诱导分化为DA神经前体细胞。然后，通过荧光激活细胞分选技术从分化的细胞中分离和并富集获得CORIN阳性细胞。研究结果显示，经过筛选的CORIN阳性细胞相比未筛选细胞，中脑标志物（LMX1A、EN1）和中脑底板标志物（FOXA2）的表达水平较高，而后脑标志物（GBX2）和前脑标志物（SIX3）的表达水平较低。

接下来，研究团队将分化所得的DA神经前体细胞移植至PD模型小鼠中进行实验。结果显示，与未筛选细胞来源的移植物相比，CORIN阳性细胞来源的移植物中表达DA神经细胞标志物（TH）的存活细胞数量更多，且可见明显的神经突起延伸。而且，移植了CORIN阳性细胞的PD模型小鼠的运动能力显著恢复。此外，CORIN阳性细胞来源的移植物中增殖细胞占比不足0.1%，提示肿瘤形成风险极低。基于以上结果，研究团队最终得出结论，以CORIN表达与否进行筛选，在DA神经元的纯化富集中具有重要价值。

（论文中使用的小分子化合物，FUJIFILM Wako可提供：Y-27632、A-83-01、CHIR99021、Purmorphamine）

另外，京都大学的高桥老师在上述论文基础上，进一步确认了由iPS细胞分化而来的DA神经细胞在非人灵长类PD模型脑内也能产生多巴胺并改善运动症状^3）。而且，在临床前试验中确认了肿瘤形成性、毒性及体内分布等安全性指标后，相关研究已进入临床试验阶段^4-5）。整个实验和临床试验中使用的DA神经细胞，均采用上述论文建立的方案，由iPS细胞分化而来。

【人肝芽类器官】

类器官是通过将干细胞分化为特定细胞，并通过三维培养再现器官特征的多细胞培养体。制备的类器官不仅可用于移植至人体的再生医疗，还能用于新药研发，评估候选药物在人体内的作用效果。此外，类器官还广泛应用于器官发育及病理生理学的研究，展现出多方面的实用价值。然而，如何精准诱导细胞分化，忠实复刻单个器官的原生结构，尤其是构建组织特异性的血管网络，仍面临着重大挑战。

Saiki等人^6）成功建立了从iPS细胞分化为肝窦内皮前体细胞（iLSEP）及肝窦内皮细胞（LSEC）的方案。进而，研究团队利用新开发的气液界面培养方法（IMALI法），成功实现了由三种肝芽前体细胞和iLSEP共同自组装，形成具有多种内皮细胞亚群的人肝芽类器官（HLBO）。在自组装形成的HLBO中，iLSEP可进一步分化为iLSEC，并观察到其表达LSEC的特征性标志物 — 凝血因子VIII（FVIII）^※，且具有多孔结构。此外，通过小鼠移植实验，研究人员还报告了HLBO在体内能够形成功能性类窦状血管网络。在此研究中，研究人员通过单细胞测序（scRNA-seq）证实，该HLBO包含动脉样、静脉样和类窦样等多种血管内皮细胞亚群，且随着培养时间推移，窦样内皮细胞逐渐占据分化优势。

此外，鉴于肝脏的重要功能之一在于合成和分泌多种凝血因子，研究团队还检测了HLBO分泌蛋白质的凝血活性。结果显示，HLBO中FVIII的分泌水平显著高于传统肝脏类器官模型，并且在30天的培养过程中持续产生FVIII。同时研究还表明，HLBO产生的凝血因子在in vitro能够缩短缺乏凝血因子的血浆的凝血时间，在in vivo则显著减少了患有A型血友病小鼠的出血时间和出血量。

今后，基于本研究构建的肝脏类器官，有望推动血管结构的深度解析、药物动力学分析，以及A型血友病等血液凝血功能异常疾病治疗方法的研发等研究的进展。

※ 凝血因子VIII：一种由肝脏合成、参与血液凝固的蛋白质。当其不足或缺失时，止血功能将受损，进而诱发A型血友病。

（论文中使用的小分子化合物，FUJIFILM Wako可提供：CHIR99021、SB431542、Y-27632）

【无需基因导入的细胞重编程】

近年来的重要技术革新是，已有研提出不依赖山中因子即可制备iPS细胞的方法。其中包括利用小分子化合物将体细胞重编程为多能干细胞，以及直接诱导分化其他体细胞的技术。通过化学刺激将体细胞重编程获得的iPS细胞被命名为CiPSC（化学诱导多能干细胞，Chemically Induced Pluripotent Stem Cells），由于能够排除外源基因导入带来的风险，因此备受关注^7）。

Liuyang等人^8）通过筛选小分子化合物和系统性的培养条件优化，成功将成人脂肪来源的间充质细胞重编程为CiPS细胞。该研究建立的诱导方案分为三个培养阶段：第一阶段将体细胞诱导为上皮样细胞，第二阶段转变为中间可塑性细胞，第三阶段则诱导形成具有多能性的原代人CiPS细胞。各阶段的培养基均分别添加10种以上小分子化合物。该方案最短可在16天内完成，论文中报道所有受试供体（n=17）均成功生成了CiPS细胞。此外，重编程效率最高达31%，平均为9.5%。

研究团队验证证实，所制备的细胞表达OCT4、SOX2和NANOG等干细胞标志物，且其全基因表达谱、全基因组DNA甲基化模式及组蛋白修饰状态均与人ES细胞相似。此外，in vitro类胚体形成实验和in vivo畸胎瘤形成实验均表明，所制备的CiPS细胞能够分化为三个胚层所有代表性的细胞类型，提示本方案所建立的CiPS细胞符合多能干细胞的标准。

此外，研究团队的另一篇论文成功将CiPS细胞分化为胰岛，且利用分化所得胰岛制备的制剂，已进入糖尿病治疗的临床试验阶段^9）。

（论文中使用的小分子化合物，FUJIFILM Wako可提供：CHIR99902、616452、TTNPB、SAG、Dorsormorphin、5-Azacytidine、PD0325901、SB590885）

【从黑猩猩体内建立的原始态iPS细胞】

原始态iPS细胞不仅在再生医疗等领域具有潜在应用价值，同时也被广泛用于揭示生殖细胞发育及更早期胚胎发育机制的研究（关于原始态iPS细胞将在下文要点中详细说明）。目前已从人、小鼠、大鼠等物种中成功建立原始态iPS细胞系，但这些细胞系的自我复制能力和胚外分化能力因物种而异。例如，小鼠原始态iPS细胞不具备分化为胚外组织的能力，而人原始态iPS细胞则具备这一分化能力。而这种分化能力是否为人类特有，还是其他物种也存在，目前尚不明确。为了更深入分析原始态iPS细胞的作用机制，亟需建立新物种的原始态iPS细胞系。

Huang等人^10）报道，通过在培养基中添加对维持人原始态iPS细胞至关重要的四种因子——MEK抑制剂PD0325901、Wnt抑制剂Xav939、PKC抑制剂Go6983和LIF，以及Activin、IL6和PRC2（多梳抑制复合物2）抑制剂，成功从黑猩猩体细胞中稳定建立维持培养原始态iPS细胞。该方法制备的原始态PS细胞表现出与人原始态iPS细胞高度相似的基因表达模式，且证实具备分化为胚外组织的能力。此外，研究还将制备所得的原始态iPS细胞进行分化，并成功构建了胚泡模型（Blastoid）。这一发现不仅有望推动灵长类动物早期发育过程的研究，也有望通过与人原始态iPS细胞的比较，获得关于生物胚胎发育的全新见解。

鉴于上述PRC2抑制剂对黑猩猩原始态iPS细胞自我增殖能力具有提升效果，研究人员进一步调查了PRC2抑制剂对人原始态PS细胞的影响，结果表明，PRC2的活性抑制同样促进了人原始态PS细胞的自我复制能力。

此外，通过抑制PRC2，即使在无饲养层细胞的条件下，人原始态iPS细胞仍能持续增殖。而既往研究普遍认为，人原始态iPS细胞的培养通常依赖于饲养层细胞，缺乏饲养层会导致细胞增殖速度减慢，最终停止生长。研究同时证实，在PRC2抑制条件下培养的人原始态iPS细胞，其基因表达谱和分化能力与有饲养层细胞条件下培养的细胞相当。

（论文中使用的小分子化合物，FUJIFILM Wako可提供：PD0325901、XAV939、Go6983、Y-27632、A83-01、CHIR99021、Forskolin）

<要点：原始态与始发态多能干细胞>

原始态iPS细胞和始发态iPS细胞均属于多能干细胞，根据分化成熟程度及其特征差异进行区分。这两种细胞并非完全不同的细胞，只是将更接近早期发育状态的称为“原始态”，而具有较晚发育阶段特征的则称为“始发态”。已知原始态iPS细胞比始发态iPS细胞具有更高的自我复制能力和多能性。此外，从不同物种获得的原始态和始发态细胞类型也有所不同，例如小鼠ES细胞和小鼠iPS细胞一般属于原始态，而人ES细胞和人iPS细胞一般为始发态。有趣的是，尽管人ES细胞与小鼠ES细胞均来源于着床前的受精卵，但人ES细胞却显示始发态的特征。

为了更深入揭示原始态PS细胞的机制，正如前文所述，亟需建立多物种的原始态iPS细胞系，并系统研究其生物学特征及物种间的差异。

◆参考文献

相关产品：MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2