富士胶片和光纯药株式会社 生物技术中心 山本阳太郎
◆前言
近年来，随着再生医疗产品和生物制药的发展，对无菌检测快速化及可靠性提升的要求也日益提高。基于传统培养法的无菌检测从开始检测到结果判定通常需要14天，这不仅可能导致产品供应延迟，也给质量管理带来了诸多限制。
此外，药物无菌性不能仅依赖于最终检测结果，还应通过覆盖整个生产过程的无菌保障体系加以保证1）。在GMP和PIC/S中，无菌检测并非直接证明无菌性的手段，而是作为确认无菌保障体系有效性的补充措施¹）。因此，除环境管理、设备适格性评价和工艺验证外，过程监控，即过程中检测的重要性也日益凸显。特别是快速微生物检测技术，有助于早期发现工艺异常，降低质量风险²）。此外，近年来，基于“质量源于设计”（Quality by Design，QbD）的理念，倡导从工艺设计阶段就把控并构建质量的方法³），并在此基础上，引入基于工艺数据保障产品质量的“实时放行检验”（Real-Time Release Testing，RTRT）概念⁴）。为实现上述目标，能够在生产过程中快速且高度可靠地检测微生物的技术不可或缺。
◆RiboNAT™ 快速无菌检测的特征
在基于核酸扩增法（NAT法）的快速无菌检测中，传统方法以基因组DNA（gDNA）为检测对象，而RiboNAT™快速无菌检测（RiboNAT™）的最大特点是采用了核糖体RNA（rRNA）作为检测对象。细菌以23S rRNA为靶标，真菌/霉菌则以28S rRNA为靶标。rRNA在活细胞中含量丰富，且与DNA相比，细胞死亡后会迅速降解，因此被认为是反映活菌存在的有效指标。基于这一特性，能够有效减少传统gDNA检测方法中因死菌残留gDNA引起的假阳性问题。
该方法如图1所示，包括以下几个步骤：①微生物活化及游离核酸的灭活；②利用酶和表面活性剂进行快速裂解并提取RNA；③通过一步法实时RT-PCR进行检测。通过该方法，传统需要14天完成的无菌检测可缩短至约7~18小时完成。采用该方法对《日本药典》第十八版（JP18）4.06《无菌试验法》规定的代表性试验菌进行检测时，也显示出较高的检测灵敏度，且已确认可检测低菌数（数CFU/mL水平）。此外，由于该方法不会与人细胞或培养基成分发生交叉反应，因此非常适用于再生医疗等产品的无菌检测。关于RiboNAT的性能数据，请参考我司相关产品的介绍页面，下文就gDNA污染的影响及大体积样品的检测方法作部分介绍。
图1. RiboNAT™ Assay Flow
图2. 微生物浓缩方法概述
◆使用RiboNAT™ 检测数十毫升样品的方法
在RiboNAT™标准检测方法中，无论是好氧菌还是厌氧菌，均使用1 mL以下的样本量。然而，对于部分客户来说，这一处理量可能无法满足其检测需求。和光纯药时报Vol.94 No.1（2026年1号）中发布的文章《【综述】再生医疗领域如何选择快速无菌检测法及相关问题》中也提到了样品中的微生物浓缩技术仍存在一定的挑战5）。本文将介绍利用离心和过滤进行微生物浓缩的方法及部分结果。在10 mL样品中分别各添加18 CFU的不同微生物后，按照图2的流程进行微生物浓缩，随后根据RiboNAT™ Assay Flow进行检测。
结果如表1所示，确认能够检测6种微生物。今后，我们计划进一步推进大体积样品的检测方法，包括采用过滤的方法，以及仅进行离心与去除上清液操作的方法。
孔内数值为Cq值，每个测试设置双孔检测
表1. 使用不同微生物浓缩方法检测的结果
◆关于RiboNAT™ 对gDNA混入的耐受性
为评估RiboNAT™ Assay Flow中混入gDNA时对假阳性抑制的效果，在裂解步骤中添加大肠杆菌来源的gDNA（每次提取中的添加量为30 ng），然后通过比较是否实施第1次DNase处理（1st DNase）和第2次DNase处理（2nd DNase），确认Cq值和核酸量的变化。
结果如图3所示，经DNase处理后，Cq值增加约16个循环（ΔCq≈16）。仅进行第1次DNase处理即可使gDNA减少99.992%；在第2次DNase处理后，也确认了同等水平的降低效果（表2）。因此，RiboNAT™ Assay Flow即使在混入纳克量级gDNA时，检测也不会受到明显影响，显示出较高的耐受性。
图3. 各检测条件中Cq值与未处理样品的差异
表2. 各检测条件下洗脱液中gDNA浓度及减少率
◆结语
本文介绍了RiboNAT™ 的性能以及大体积样品的检测方法。这些结果表明，RiboNAT™可适用于多种应用场景。
如前所述，关于无菌保证的理念，监管机构发布的相关文件中均有记载。另一方面，在Montag-Lessing,T等人发表的学术论文中也指出生产工艺中全程管控的重要性6）。因此，快速无菌检测方法不仅限于核酸扩增法，基于多种不同技术的实际应用也正在积极推进5）。
关于核酸扩增，美国药典（USP）正在推进针对有效期较短产品的核酸扩增法的相关文件，并以USP Chapter <75>的形式开展。FUJIFILM Wako也将继续支持各国相关文件的制定工作，致力于为客户提供更加便捷易用的检测方法。
RiboNAT™采用以rRNA为靶标的核酸扩增法，可实现对活菌的快速特异性检测。不仅可以作为传统成品放行检验的替代或补充方案，更有望应用于生产过程中检测，并成为支持“实时放行检验”等无菌保障策略的基础技术。
【参考文献】
| 1. | Pharmaceutical Inspection Co-operation Scheme. PIC/S guide to good manufacturing practice for medicinal products : Annex 1 - Manufacture of sterile medicinal products. （2022）. |
| 2. | Parenteral Drug Association. PDA technical report no. 33 : Evaluation, validation and implementation of alternative and rapid microbiological methods. （2014）. |
| 3. | International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. ICH Q8 （R2）. （2009a）. |
| 4. | International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. ICH Q10 : Pharmaceutical quality system. （2009b）. |
| 5. | 松山 晃文：和光純薬時報 Vol.94 No.1 （2026）. |
| 6. | Montag-Lessing, T. et al. : Bundesgesundheitsblatt, Gesundheitsforschung, Gesundheitsschutz, 53, 45 （2010）. |
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