小鼠生殖工程学技术——5冻存运输小鼠２细胞期胚胎

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◆材料

1.     2细胞期胚胎（新鲜或冻融复苏后的胚胎）

2.     培养皿（coring　35mm X 10mm　Cat.No.430588）

3.     电动移液器（GILSON　PIPETMAN　P-200）

4.     M２ Medium (Sigma Cat.No.M7167)

5.     0.5 mL EP管（Fisherbrand Flip Cap Microtubes 0.5 mL, Fisher Scientific Cat.No. FS-MCT-060-C）

6.     微管

7.     KSOM/AA

8.     流动石蜡（Nacalai Tesque Cat.No.26137-85）

9.     纽扣式温度记录仪（KN Laboratories temperature data logger Samokuron G type）

10.  CARD 冷藏运输试剂盒

o    纸盒（free-s1 Cat.No. 11-1585）

o    棉布

o    保温瓶（Thermos Co., Ltd.　Cat.No.JMK-501）

o    冰袋（小）（Kyoritsu Co., Ltd.　冰袋雾凇　Cat.No. H-120）

o    冰袋（大）（shiro产业　冰袋R 500g 140 mm×250 mm、Cat.No. M250R-50）

o    泡沫箱（KARUX　KC-3）

◆步骤

2細胞期胚胎的冻存

１.　用移液器（P-200）在培养皿上制作两个１００μL M２的滴液（不要被流动石蜡覆盖）。
２.　把冻存的胚胎从被流动石蜡覆盖着的培养液里移至到一个M2滴液里。

３.　更换新的微管，将胚胎从一个M2滴液移至另一个M2滴液里。

      ＊把从被流动石蜡覆盖的培养液滴液移至制作好的M2滴液里的胚胎移至到另一个M2的滴液时，尽量避开附着流动石蜡的滴液位置。

４.　往０.５mL EP管内加入０.６mL的M２。 
    

    ＊如果EP管顶部留有气泡时，需轻拍出气泡。

５.　从3个滴液里取出胚胎后放置在装满０.６mL的M２０.５mL EP管底部（一只EP管能放40个2细胞期胚胎）。

＊ 移动胚胎后，在3个滴液里移液，确认微管里是否残留胚胎。

６.　合上EP管盖子，并用封口膜包封。
７.　在纸盒里装入EP管、纽扣式温度记录仪和棉布后，盖上盒盖紙箱。
　　 M２、紙盒、EP管、纽扣式温度记录仪和棉布全在室温（20～25°C）下使用。

８.　纸盒保存在冷冻柜里（最长可保存72小时）。 

2細胞期胚胎的冷藏运输

与上述冻存步骤一样，把EP管放进纸盒（2细胞期胚胎的冻存1~7步）后，按以下操作包装纸盒。

样品是常温的情况只需用保温瓶和小冰袋，4~8°C冻存的样品，则需要使用泡沫箱及大冰袋，包装时动作要迅速。

１.　把纸盒放进保温瓶内。

２.　再放进两个小冰袋至保温瓶内。 

３.　紧紧盖上保温瓶盖。

４.　确认瓶盖盖紧后，在泡沫箱内铺上大冰袋，然后放入保温瓶（这时，请注意请勿倒放保温瓶里装有胚胎的EP管）。 接着，保温瓶两侧也放上大冰袋。最后用包装带固牢泡沫箱盖。 

５.　用快递运送，整个泡沫箱保存在（４～８°C）冷冻柜里。

６.　用快递冻存运输最长保存时间可达72小时。
    

  ＊冬季的室外气温会低至０°C以下，如果运输过程中泡沫箱长时间放置在室外，2细胞期胚胎就会死亡。寄方应首先联系附近的快递配送站，跟他们强调泡沫箱内放有活细胞，请注意切勿放置在室外。

更改 : 2013.03.06 放有2细胞期胚胎的纸盒与冰袋放进保温瓶的顺序互换，因为先放冰袋后放纸盒，使纸盒难以受到内外气温差的影响，原页面请点击此处。

从冷藏运输试剂盒里取出2期细胞胚胎

1. 　注入3滴100μL 的KSOM/AA在培养皿上，然后用流动石蜡覆盖。把培养皿放入培养箱里孵育至少30分钟。 

2. 　从保温瓶里取出放有样品的纸盒。

3.　 纸盒在室温下放置30分钟。

       注意: 胚胎将在30分钟内沉在EP管底部。

4.　 打开纸盒，轻轻地取出棉花，一旦取出棉花后，要拿起装有胚胎的EP管，并打开盖子。

5. 　用灌注凝胶枪头收集EP管中M2上清液200μL，然后转移到培养皿的边缘。

6. 　用灌注凝胶枪头小心地把全部M2包括在EP管底部的胚胎移至培养皿的中心。
      注意: 为了方便操作，在使用移液器时尽量避免吸入空气。

7.  　从M2里采集的胚胎，分别转移至3个100μL KSOM/AA 滴液中，进行清洗。

 注意:  如果不能移走所有的胚胎，可以用培养皿边缘上的200μL M2滴液来清洗EP管内部。

8.　 然后把胚胎移植到代孕小鼠的输卵管内。

　  注意:　理论上，在胚胎清洗完至移植到代孕小鼠体内的这一过程需在短时间内完成。 (请参考“胚胎移植入输卵管”)