果汁中嗜热嗜酸菌的检测方法——膜过滤法和涂布法

◆背景

　　此方法用于分析检测果汁成品或原料。此文件细节性地描述了嗜热嗜酸菌（以下缩写为TAB）的定量检测和其确认测试。此文件含有关于TAB的定义，描述和其他的相关信息。

◆原理

　　在浓缩果汁，特定甜味剂和一些饮料中，TAB（脂环酸芽孢杆菌）主要以孢子的形式存在。这些孢子的活性往往在高温杀菌，并且有合适的生长环境的条件下增长。TAB不会在冷饮中生长。如果环境允许，TAB会生成一种名为愈创木酚的化合物。此化合物会给产品和原料带来一种药的味道。基于此药味，样品被认为是腐坏了。

◆原料和标准品

a．酵母提取物（212759，BD）

b．葡萄糖（215530，BD）

c．可溶性淀粉（217820，BD）

d．琼脂（214530）

e．愈创木酚测试套装

◆仪器设备

a．水浴锅

b．培养箱

◆实验过程

a．培养基（YSG）配制

i．溶液A：在1L烧杯中称量2g酵母提取物，1g葡萄糖和2g可溶性淀粉。加入500mL去离子水溶解。加入适量1N的盐酸或硫酸，使pH调整至3.7±0.1。

ii．溶液B：取一个新的1L的烧杯。称量15g琼脂并加入500mL去离子水加热溶解。

iii．在121°C下蒸汽灭菌15分钟。

iv．当溶液A和B的温度都降至47±0.2°C时，在无菌条件下将溶液A倒入溶液B中混合。

v．在培养皿中倒入15至20mL配置完成的培养基（YSG）并使其凝固。将浇好的培养皿放入冰箱中存放。保质期为一个月。

b．样品准备（热击）

i．在试管中准备9mL的无菌水，在无菌条件下加入1mL浓缩果汁并混匀。

ii．将试管置于80°C水浴锅中热击。当样品温度到达80±0.2°C时计时10分钟。然后快速降温至室温。

iii．如果样品为单倍果汁，则无需稀释。

c．样品分析方法

i．涂布法（用于不可过滤的样品）：

1．向固体YSG培养基中加入1mL热击过的稀释样品（单倍果汁无需稀释，直接取1mL样品）。将样品均匀涂抹在培养基表层。

2．将平板正放于45±2°C培养箱中培养一天。

3．一天后倒置平板并继续培养4天。

ii．膜过滤法（用于可过滤样品）：

1．在50mL无菌水中加入热击过的稀释样品（单倍果汁无需稀释，直接取10mL样品加入）。混匀后用0.45µm滤膜过滤。

2．在无菌条件下将滤膜转移至固体YSG培养基上。

3．倒置平板，在45±2°C培养箱中培养5天。

d．结果分析

i．如果样品中菌落计数小于原料标准要求，用愈创木酚测试套装进一步检测会有无产生邻甲氧基苯酚的微生物。如果菌落计数大于原料标准要求，则直接认定为不合格样品。

ii．阳性平板应通过显微镜镜检来确定脂环酸芽孢杆菌的存在。

iii．每一套测试样品需要有控制平板做比对。包括空气，阳性菌对比，YSG培养基和样品所使用的无菌水。

e．愈创木酚测试套装

i．用接种环取10 µL不含孢子的新鲜菌落，悬浮于含有“Va-YSG 试剂 (2mL)”的试管中（≥1×108cfu/mL）。

ii．在45±1°C下培养3小时或过夜。

iii．加入1mL邻甲氧基苯酚测试套装试剂1。

iv．加入20µL邻甲氧基苯酚测试套装试剂2。

v．加入20µL邻甲氧基苯酚测试套装试剂3。

vi．混匀并放置5－10分钟。

vii．观察溶液的颜色变化。在10分钟内读取数据。

viii．阳性控制：取2mL纯净水和100µL阳性控制并混合。重复步骤iii－vii。

ix．空白：取新的“Va-YSG”试剂并重复步骤ii－vii。

◆质量控制检测

a．这项测试需要含有少量TAB阳性菌的可过滤果汁样品作为过程检查。

b．向10mL离心管中加入1mL阳性样品（浓缩）。加入9mL无菌水或缓冲剂。

c．80±2°C热击10分钟。

d．取1mL样品至50mL无菌水中混合。

e．过滤并把阳性控制储藏在冷冻（-18°C）条件下。

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