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愈创木酚检测试剂盒
Guaiacol Detection Kit

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Guaiacol Detection Kit



◆背景

 

嗜酸耐热菌Alicyclobacillus acidoterrestris 是革兰氏阳性,产芽胞厌氧菌,在自然界中普遍存在。1984年透明苹果汁混浊事件后该物种被大量研究。生长在相对高的温度和酸性条件下的Alicyclobacillus 类细菌,称为热-嗜酸性杆菌(TAB) [1, 2, 3].

TAB 不能通过巴氏消毒法被灭菌,可能残留在合成的食物和饮料中。尚不清楚 TAB 是否对人体有害,但产生有异味的愈创木酚,会降解果汁和其他产品的质量。即使没有异味,在分配过程中轻微恶化引起的降解也会降低产品的质量。

避免 TAB 污染是非常困难的,特别是在土壤中。幸运的是,引起污染的A. acidocaldarius 和其他主要物种被认为是无害的,TAB 引起的损害能够通过监测被认为有害的A. acidoterrestri 来缩小。因为这些物种生长相对高温和酸性的条件下,不能通过常规的提取培养的方式进行检测。

由于欧洲和其他区域经常发生果汁质变事件,2003年3月日本果汁联合会研发和出版了同一检测 TAB 方法 [4]。为了容易进行该项检测,我们研发了该试剂盒。该试剂盒不同于会产生异味的愈创木酚的A. acidoterrestri 试剂盒

Guaiacol Detection Kit Reference

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a-YSG Medium

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Guaiacol Detection Kit



◆试剂盒组成


YSG 琼脂板 20 块板(货号 KYO-06810)

TAB 纯化的 YSG 琼脂培养基

10×2 板/1 盒

 

Va-YSG 培养基 (2 mL) 100 个管子(货号 KYO-08901)

加入到 YSG 培养基的 Vanillic acid ,用于愈创木酚的形成

2 mL×100 管

 

愈创木酚检测试剂盒 100 次(货号 KYO-08921)


试剂1:50 mM 苯二甲酸氢钾缓冲液

60 mL×2 瓶

试剂2:1.3 % 过氧化氢溶液

2.5 mL×1 管

试剂3:过氧化物酶-磷酸缓冲液

2.5 mL×1 管

阳性对照:Guaiacol  (1050 ppm)

2.5 mL×1 管

 


◆TAB 测试流程图-日本果汁协会


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◆实验流程

1. 用10 μL接种环在YSG琼脂板上提取新菌落(无孢子)。在“Va-YSG medium (2 mL)”(≥1×10cfu/mL)管内重悬该菌落。

2. 孵育 45±1°C,3小时。

3. 加入1mL“Guaiacol Detection Kit”的试剂1。

4. 加入 20 μL“Guaiacol Detection Kit”的试剂2。

5. 加入 20 μL“Guaiacol Detection Kit”的试剂3。

6. 混匀。

7. 放置5-10 min。

8. 检测培养基颜色的变化。在10 min内读数。


1417156552612645.jpg


空白(阴性对照) 

使用没有接种的"Va-YSG medium(2mL)" ,进行步骤2-8


阳性对照

2 mL灭菌水和 100 µL阳性对照混合,进行步骤3-8

处理信息

• 请使用高压灭菌方式处理已经使用的培养基(121℃,超过30 min)

• 保存条件:2-10 ℃,避光


• 保质期:制造后12 个月

一般我们提供的产品保质期在3个月到10 个月。

◆实验结果

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① Negative Control

② A. acidoterrestrs B2067

③ A. acidoterrestrs ATCC49025T
④ A. acidocaldarus ATCC27009T
⑤ A. acidocaldarius HP2
⑥ A. genomic sp. P2
⑦ A. genomic sp. DSM11983 



欲了解详情资料请点击:果汁中嗜热嗜酸菌的检测方法——膜过滤法和涂布法


Q1:  我对 TAB 列举法有些问题。

          a. YSG 灭菌水是什么意思,我想知道制备的比率。

          b. 阳性/阴性测试:样品制备步骤提到的用 YSG 培养基稀释,稀释比例是多少?
          c. 如果是水样品的话,是不是用相同方法?


A1: (a,b)回答: 
           "YSG distilled water"是错误说法,正确的说法是“灭菌水”。制备比例的话,请参考下面的
信息,不过具体案例具体分析。

           (参考数据来自日本果汁联合会R)

           --------------------------------------------------------
           果汁      〔Brix 值〕   参考比例  
           ---------------------------------------------------------
           苹果        〔70〕 ・・・・・・・・  10 倍
           橙子      〔65〕 ・・・・・・・・  10 倍
           红葡萄     〔65〕 ・・・・・・・・  20-50 倍
           白葡萄         〔65〕 ・・・・・・・・   20 倍
           胡萝卜       〔40〕 ・・・・・・・・  10 倍
           柠檬        〔50〕 ・・・・・・・・  10 倍   
           葡萄柚         〔55〕 ・・・・・・・・   20 倍
           桃子        〔55〕 ・・・・・・・・・10 倍
           ---------------------------------------------------------
            c. 水样品的话,是不是用相同方法?
            回答(c):对不起,我们不能明确告知是否可以运用,我们手头没有相关记录。
           有一种软饮料“near water",来自调味品,不是果汁(或者少量)和水。我们听说该款产品可用
于检测该类饮料。 


Q2:   果糖能够作为样品吗?

A2:   非常抱歉,我们这边没有关于愈创木酚检测糖果(果糖)样品的相关知识。所以我们建议参考简单流程,该流程修改自 

         “Japanese spore counting method of sugar samples”。如果你们有预处理微生物测试的流程,请按照你们的操作流程操作代替操作

           流程中的“样品制备“。该流程中有制备 YSG 液体培养基的方法。如果 您使用我们提供的流程,不需要使用接种环和 YSG 琼脂板。


Q3:   我们使用该试剂盒鉴定 Alicyclobacillus acidoterrestris。我们的客户是做墨西哥沙拉的,它们也有类似愈创木酚的异味。我们是否可

           用该试剂盒去检测沙拉中的愈创木酚(主要西红柿,红色)?红色是否会干扰?

A3:   我们这边没有数据是关于愈创木酚检测试剂盒检测沙拉酱的案例。如果您考虑观察方法,请参考下面的"注意事项" 。

           注意事项(1):来自样品的固体如果样品的固体中有 AAT,必须采取胃部处理或者匀浆去除固体的致病菌。

           注意事项(2):材料中多酚的影响多酚是 AAT(Alicyclobacillus acidoterrestris)生长抑制剂。因此,检测 AAT 必须稀释样品 20~50

                                     倍。否则,无法检测出来。我们不清楚沙拉中有多少多酚。但是西红柿是含有多酚的。一般稀释 10 倍。可以考虑沙拉稀

                                     释超过 20 倍。

           注意事项(3):关于样品的粘度。稀释降低粘度。因子样品必须适当稀释。请参考微生物稀释比例检测样品,不包括抗热嗜酸性细菌。

           注意事项(4):关于样品到标本上携带的颜色如果最终采用过氧化物酶方法,如果样品带有棕色的话,可能判断起来很麻烦。如果样品

                                     稀释的话,我认为不会引起大问题。

           注意事项(5):其他干扰材料如果使用过氧化物酶方法,通过过氧化物酶反应会使愈创木酚(AAT 产物,会引起异味)聚合并且变成棕

                                     色。我们认为沙拉酱包括不同的香味料可以作为材料。因此,如果有材料抑制过氧化物酶反应或者含有的物质可以起过

                                     化酶作用,通过过氧化物酶反应变成棕色,会引起假阳性或者假阴性的结果。


Q4:  如何接种 TAB 到 YSG 琼脂板上面?请提供流程。

A4:    根据 Japan Fruit Juice Association,有3种方法

            1)倾注平皿的方法

            2)用曲面玻璃棒涂布平板的方法 
            3)MF 方法
            如果告知客户的样品和检测方法,我们可以推荐方法。

            对于您的信息,请让我们知道在我们手册里面 TAB 检测的流程。


Q5:    是否提供不含香草酸的 YSG 培养基?

A5:    是的,我们提供不含香草酸的 YSG 培养基。然而售价会高,也需要额外时间考虑生产。另外,小批量生产会比较难。


Q6:    是否有数据或者参考文献显示 Guaiacol detection kit 的准确性? 我们的客户希望提供上述信息。

A6:    关于产品的准确性,Japan Institute of fruit juice 认可检测操作手册还有手册上提到的批次准确性的数据。

            然后,英文版的操作搜出不提供准确性的信息。

            关于您的要求,请参考下面有研发者 by developer(Motohiro Niwa)写的论文 "Development of a rapid detection method of 

            A. acidoterrestiris, Hazardous bacteria to acidic beverage"。


Q7:   我们需要下面两者之一的微生物菌株 A.acidobacillus 或者 A.acidoterrestris 去完成分析,制定质量政策。是否可以从你们那边获得?

A7:   非常抱歉我们不能提供细菌菌株。您可以通过 ATCC 和 DSMZ 的当地经销商联系购买。

           http://www.atcc.org/About/tabid/138/Default.aspx
           http://www.dsmz.de/
           下面的菌株是分泌愈创木酚的。
           ----------------------------------------------------------
          ・ A.acidoterrestris ATCC49025
          ・ A.acidoterrestris DSM2498
          ・ A.acidoterrestris DSM3923
          ・ A.acidoterrestris DSM3924

Q8:    该试剂盒是否可用于牛奶或者啤酒?

A8:     关于牛奶和啤酒,我们没有相关的信息。


Q9:    该试剂盒可以检测多少愈创木酚?

A9:     Va-YSG 培养基 和 Guaiacol detection kit 能够检测 25 ppm 愈创木酚。


Q10:  是否与关于假阳性结果的信息?

A10:   如果样品中有过氧化物酶或则过氧化氢酶的话,我们试剂盒可能还有假阳性的结果。


Q11:  是否可用 BAT 培养基代替YSG琼脂?

A11:   他们的 YSG 琼脂用这个试剂盒是可以的。我们推荐使用 Va-YSG(KYO- 08901)用于下一步实验室(在 YSG 琼脂上孵育后)。我们的

             剂盒是基于 Japan Fruit Juice Association 的操作流程, 不推荐使用 BAT 培养基。所以不能保证使用 BAT 培养基的结果。


Q12:  是否可用来检测糖果?

A12:   对不起我们这边没有这方面信息。可以参考“Japanese spore counting method of sugar samples”。

             如果您与细菌检测的预处理流程,请使用您的实验流程代替样品处理。该流程中,有 YSG 液体培养基的制备方法。如果您使用我们建议

            的流程,需要接种环和 YSG 琼脂板。如果不适合您的样品,建议修改。


Q13:    该试剂盒是否可以检测 Ethylvanillin 到 Ethoxyphenol 转变?Ethoxyphenol 也会类似愈创木酚,会有异味?

A13:  该试剂盒有比色法的结果,通过过氧化物酶反应愈创木酚转变成四-愈创木酚检测愈创木酚。关于2-Ethoxyphenol, 也会发生过氧化物酶反

            应,会有比色法结果。然而我们之前没有测试过,也没有看到相关的文献,不能确定。在很多化学物质数据库中我们也没有找到关于异味是

            由 Ethoxyphenol 引起的信息。


Q14:  该试剂盒可检测蜂蜜吗?

A14:     对不起,我们没有做过类似实验。




360截图20160308164058828.jpg


Guaiakol detection kit reference



【1】

G.Deinhard, et al., Bacillus acidoterrestris sp. nov., a new thermotolerant acidophile isolated from different soils. Syst. Appl. Microbiol. 10, 47-53 (1987)


【2】

GOTO, M., Spore-forming thermo-acidophilic bacilli of the genus Alicyclobacillus, Bokin Bobai, 28 (8), 499-508 (2000), in Japanese


【3】

GOTO, K., Lecture on "Classification and identification of microbes" 1. Classification and properties of new thermo-acidophilic bacilli, January 2001 issue of Soft Drink Technical Data, 9-26 (2001), in Japanese


【4】

Niwa, M., et al., Development of a rapid detection method of A.acidoterrestris, hazardous bacteria to acidic beverage. Fruit processing, 13, 102-107 (2003)


【5】

Japan Fruit Juice Association, On the unified test method for thermo-acidophilic bacilli, Report of Japan Fruit Juice Association, 535, 4-12 (2003), in Japanese


【6】

Niwa, M., et al., A.acidoterretris rapid detection kit, Fruit processing, 13, 328-331 (2003)


【7】

Niwa, M., Control of deleterious bacteria in acidic beverages by using a guaiacol detection kit (peroxidase method), Japan Food Science, 2004-2, 23-28 (2004), in Japanese


【8】 

Japan Laid-Open P2003-259A “Detection of guaiacol forming bacteria and/or its identification method”




产品列表
产品编号 产品名称 产品规格 产品等级 备注
KYO-06810 YSG Agar Plate
YSG琼脂平板
20 PLATE - -
KYO-08900 Va-YSG Medium
脂环酸芽孢杆菌/嗜热耐酸芽孢杆菌 培养基
2 mL×100 - -
KYO-08920 Guaiacol Detection Kit
愈创木酚检测试剂盒
100 tests - -

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