1．Ames Test 原理

　　Ames Test 就是利用细菌检测致突变性的试验。突变指的是由于生物体受到某种影响（如化学物质、紫外线、环境等）致 DNA 受损，DNA 上的遗传因子配列发生改变，使原本应该生成的氨基酸无法生成，无法再现原本的 DNA 形态。

　　细菌通过自身合成必要的氨基酸进行发育，本试验使用的菌株是通过遗传因子操作，使菌株的一部分氨基酸无法合成。通过添加化学物质引发突变使菌株能与原来的野生株一样自身合成氨基酸。对极少葡萄糖凝胶培养基（Tesmedia^® AN 培养基、Climedia AM-N 培养基）上增殖形成的菌落进行计数。

　　即将改良成无法合成氨基酸的细菌通过突变使其恢复氨基酸合成，因此又称回复突变试验。Ames Test 是以发现该试验的美国加利福尼亚大学 Ames 教授的名字命名的。

2．菌株

（1）使用菌株
　　1）鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）：TA100、TA98、TA1535、TA1537
　　2）大肠杆菌（Escherichia coli ）：WP2uvrA　

（2）菌株的选择理由

　　鼠伤寒沙门氏菌的各菌株和大肠杆菌菌株分别被改良成无法生成对应的组氨酸和色氨酸的菌株。
　　根据鼠伤寒沙门氏菌种类，可将其分为碱基对置换型和移码突变型。

　　碱基对置换型是指 DNA 上的鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C），或腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）的碱基对，在DNA螺旋结构上发生置换的菌株。移码突变型是指：为了减少 DNA 的 GC 碱基对部分（或 AT 碱基对部分）的一个碱基，对 DNA 上的碱基序列进行换段的菌株。

　　为了检测出这些突变作用（碱基对置换、碱基对脱落等），对多数菌株进行试验。

　　上述菌株可按照以下分类：

　　　碱基对置换型：TA100、TA1535、WP2uvrA
　　　移码突变型：TA98、TA1537

（3）鼠伤寒沙门氏菌与大肠杆菌

　　鼠伤寒沙门氏菌是上文提到的 Ames 教授在发现 Ames Test 过程中详尽体现突变的细菌。

　　大肠杆菌对金属离子或偶氮化合物的敏感度要比鼠伤寒沙门氏菌高，因此现在和鼠伤寒沙门氏菌被视为 Ames 测试的标准组合。

（4）鼠伤寒沙门氏菌的种类

　　在同一检测系中做２种菌株检测，碱基对置换型的 TA100 和 TA1535，移码变异型的 TA98 和 TA1537，是因为 TA100 和 TA98 加入了抗药性因子。上述菌株中含有像化学物质中的抗生物质一样的，可杀死细菌的物质。为了防止细菌死亡导致无法检测突变，因此在菌株中加入抗药性因子（氨苄青霉素抗性因子）。

3．实施实验

（1）试验
　　进行预备试验和本试验。

（2）试验目的
　　预备试验的目的是设定本试验的用量，本试验的试验目的是确认试验结果的再现性。二者除了设定用量不同之外（也有相同的情况），其他操作均相同。

（3）试验构成

　　菌株阴性对照（溶媒）、样品（设定５~７浓度）、阳性对照（１浓度）（Positive control AM multi set），分别进行通过代谢活性化和不通过代谢活性化２个系列试验。

　　使用孔板数：２板，如下所示：

　　　５菌株×７～９试验浓度（阴性对照、样品：５～７浓度、阳相对照）×２系列（不通过代谢活性化、通过代谢活性化）
　　　×２试验（预备试验、本试验）×２板＝280～360 板＋α（其中几板用于无菌试验）

（4）代谢活性化

　　人体存在因某些化学物质代谢引起的突变作用（也称变异源性），也存在因化学物质不代谢硬气突变作用的情况。本试验针对这两个情况进行实验。

　　代谢活性化的试验方法：捣碎大鼠的肝脏，在离心过（9000G）的上清液（S-9：含代谢酶）中加入辅酶（Cofacetor-I），调配好，在将其加入菌液和化学物质的反应物中。

4．试验流程

　　①　37℃ 在液体培养基中对各菌株进行震荡培养 8~10小时（菌株增殖高峰期）。

　　②　将菌液、S9 mix（代谢活性化）或 buffer（未代谢活性化）和检体溶液混合，加入软凝胶，撒开到极少葡萄糖平板培养基（esmedia^® AN 培养基、Climedia AM-N 培养基）上。

　　③　37℃ 48 小时培养后，对形成的菌落计数，观察细菌的生育抑制（用实态显微镜观察培养基中的微小细菌）。

5．用量设定

（1）预备试验

　　以 5000 μg/plate 为最高设定用量，按公比２~４，设定为５~７个阶段。

（2）本試験

　　预备试验中以细菌的生育抑制可见浓度为最高（细菌生育抑制不可见浓度为：5000 μg/plate），不显示细菌生育抑制的浓度至少含４用量，以公比２设定５~７个阶段。

6．判定基准

　　试验成立的条件为，阴性对照的自然回复变异菌落数（不做任何处理自然回复的情况）和阳性对照的回复变异菌落数均在背景数据范围内。试验满足成立条件且检体依存设定用量增加的回复变异菌落数是阴性对照的２倍以上，则判定为阳性。

　　如果不依存用量（多数情况下是最高用量的２倍或以上用量，其他用量加入后，无法观察到２倍以上的菌落数），则再次仔细地进行用量设定试验。

7．其他

　　上述表示方法仅为日本国内的标准（药事法、安卫法、化审法、农药等）。欧洲等国家以OECD化学物质测试指南为标准，其与日本国内法的差异性可作为再现性的确认。在同一条件下反复试验２次（加上预备试验，合计试验３回）。本试验中使用的孔板数为３板（由此可见预备试验做１板也ok）。

■微生物变异源性试验研究会（BMS 研究会）
　　　http://www015.upp.so-net.ne.jp/aqua-h/（外部链接）
　　刊载 Ames Test 讲座的开办、Ames Test Q&A 等资料
　　更多关于Ames Test的详细信息，请移步本研究会咨询。

参考网站

■化审法（化学物质审查规则法）最新消息：
　－（财）产品评价计数基金会机构
　　　http://www.safe.nite.go.jp/kasinn/kasinn_index.html　　（外部链接）
　－监视化学物质适用性的判定相关测试方法及判定基准　　　

　　　http://www.safe.nite.go.jp/kasinn/pdf/hanteikijyun060721.pdf（外部链接、PDF文档）
　－作为审查新化学物质的判定资料的试验结果索取

　　　http://www.safe.nite.go.jp/kasinn/pdf/GLPunyou200404302.pdf（外部链接、PDF文档）

■菌株的获取
　－（财）产品评价计数基金会机构Biotechnology本部 生物遗传资源部门（NBRC）
　　　http://www.nbrc.nite.go.jp/　　（外部链接）

■Biosafety信息
　－国立感染症研究所 病原体等安全管理规程（第三版）
　　　http://www.nih.go.jp/niid/Biosafety/kanrikitei3/　　（外部链接）
　－日本细菌学会 病原体等安全取用・管理指南
　　　http://www.nacos.com/jsbac/04-3bio.html　　（外部链接）

Ames Test用试剂

●Ames Test-S-9/Cofactor C Set 

●Ames Test-S-9/Cofactor A Set

●Ames Test-Rat liver 9,000×g supernatant fraction

●Ames Test-Positive control AM multi set

●Ames Test-Cofactor-I（S-9 Mix用）

●Ames Test - Climedia AM-N