Q：在ENZ-KIT127-0001 (E. coli host cell protein ELISA kit）和ENZ-KIT128-0001(CHO host cell protein ELISA kit)中为什么使用蛋白A亲和层析柱而不是HCP（宿主细胞蛋白）亲和层析柱？

A：主要目的是为了保证产品的一致性。蛋白A亲和柱已经使用很长一段时间了。产品很成熟，可信度高，已经被大多数生物公司和制药公司采用进行蛋白纯化。批次间的抗体纯化的质量保持稳定。另外，HCP亲和柱经常需要定制，用量不是很大。HCP亲和柱放置时间长的话，质量会恶化，导致抗体纯化的效率下降。挑选蛋白A亲和柱而不是HCP亲和柱的话，灵敏度会差些。然而，FDA认可生物制品制品中HCP的水平在1~100ppm之间。我们试剂盒的灵敏度在2.5 ppm（基于标准品曲线上的10ng/mL数据点，在药物4mg/mL中进行加样实验），满足HCP分析的各种调控条件。

Q：使用多肽提高抗体的基本原理是什么？（单抗构象ELISA试剂盒）
A：使用多肽提高抗体是为了保证整个单抗分子的系统性覆盖范围。现在对于抗体应答的理解，在抗体产生中通常需要5~6个线性氨基酸（经常只有3~4个氨基酸）形成 一个表位。使用的多肽大概30个氨基酸。每个多肽理想状态可以产生针对几个线性表位的多个抗体。构象ELISA的原理是检测单抗表面线性表位的分布。大量实验表明表面线性表的分布会改变，如果通过物理或者化学处理，比如提高温度，低pH或者高pH，氧化，糖基化，聚集等引起构象差异，也能够被构象ELISA试剂盒检测到。

Q：该试剂盒是否可用于任何新单抗或者严格的说是生物仿制药的比较吗？
A：如果是新的单抗，建议使用BioSims™ Conserved mAb sequence conformational ELISA kit（ENZ-KIT123）。由于所有人的抗体都有几乎一致的保守区域序列，覆盖保守区域（22种抗体）的抗体应该覆盖了任何人的单抗。可变区域被8种抗体覆盖。该方法的科学原理是甚至在可变区域，大约序列的66%是保守的。甚至在3个CDR区域，也有一些序列类似。在可变区域内，覆盖12个区域的8种不同抗体的使用提供了新型单抗的良好覆盖范围。另外，一种生物仿制药单抗没有被我们特异性的BioSims™ ELISA试剂盒覆盖，也可以用灵敏度不错的BioSims™ Co-nserved mAb sequence conformational ELISA kit（ENZ-KIT123）。

Q：需要检测几个批次的生物仿制药？
A：如果是监管机构登记注册的，至少需要3个批次。如果中途相似性分析，1个批次足够了。

Q：E.coli和CHO宿主细胞蛋白多抗是否纯化过？通过什么方法？
A：使用来自GE Healthcare的MabSelect™（蛋白A亲和纯化柱）进行纯化。

Q：我如何理解我的构象ELISA试剂盒的数据？
A：构象ELISA试剂盒，比如BioSims™ Bevacizumab conformational ELISA kit（ENZ-KIT123）最大差异系数是15%，意思是在成对比较中（微孔板的上面3排是对照参考单抗，下面3排是生物仿制药分子），两种单抗的del-ta OD低于15%，那就意味着没有构象差异。如果delta OD在15~50%之间，认为是有轻微的构象差异。这是基于与使用8M尿素处理的单抗。在这个实验中，单抗被8M尿素展开。在板上面，线性表位很容易被捕获抗体接触到。提供了表位暴露的参考信号。在加样测试中，如果delta OD低于50%，意味着与对照对比，少于0.1%的新表位暴露。这种差异认为比较小，因为只有与产品相关的杂质（也可以当做构象的杂质）检测到。如果delta OD高于50%，认为有主要构象差异。某些情况，如果delta OD值高于100%，则该生物仿制药有主要构象差异。

Q：CHO宿主细胞蛋白标准曲线如何制作？
A：CHO宿主细胞蛋白标准曲线是根据悬浮培养在化学成分限定培养基中的多个CHO K1细胞系制备的。细胞培养的生长条件是模拟实际CHO细胞生产的条件。来自限定培养基的宿主细胞蛋白作为标准品收集，浓缩和使用，作为产生CHO宿主细胞蛋白抗体的免疫原。

Q：为什么我要用BioSimsTM构象ELISA试剂盒用于研究我的抗体在临床的应用？
A：大多数新单抗以及生物仿制药在临床研发阶段失败。FDA已经注意到在生物仿制药研发的指导手册中提到非常重要的鉴定生物构象的能力有局限性。FDA鼓励公司使用现有最先进的技术。生物仿制药或者新型单抗的成功临床研发掌握在研发者手里。使用BioSims™ 构象ELISA试剂盒增加了临床研发成功的可能性。可以让生物仿制药的研发人员在研发期间识别潜在的构象差异并且进行修改。生物仿制药与原版相比，在结构上有类似，可以增加通过审批的可能性。现有的技术，比如荧光，分析超速离心或者胶过滤不能提供有效的单抗构象分析。使用BioSims™ 构象ELISA试剂盒也可以验证批次见的重复性。

Q：BioSims™ 构象试剂盒是如何设计的？
A：BioSims™ 构象试剂盒的设计是基于称为表位扫描的常规免疫技术。依赖于用多肽检测抗体相互作用的重叠多肽的合成，允许用抗体识别表位。多肽选择的过程考虑基本的多肽设计原理，还有二级结构的可能形式（比如：形成稳定二级结构的多肽长度，多肽合成能力等）我们设计大概30个氨基酸长度的多肽，带有4~5个重复的残基（可以覆盖所有的单抗分子），估计需要34个抗体可以评估一整个分子。

Q：能否研发抗体特异的BioSims™ ELISA试剂盒？
A：抗体特异性试剂盒可以在4个月内研发。只有12种抗体（覆盖可变区域）需要研发出来。另外覆盖保守区域的22种抗体是相同的。每种单抗的市场潜力，是否需要研发新的BioSims™ 构象ELISA试剂盒需要评估和决定。对特异性单抗感兴趣的研发者也可购买20种ELISA试剂盒。这种情况，新的BioSims™ 构象ELISA试剂盒能够研发出来。最后，Bio-Sims™ -Conserved mAb sequence conformational ELISA kit（ENZ-KIT123）提供了可变区域（66%）相对好的覆盖区域，代表了这种可能性的有趣方法。

Q：E.coli宿主细胞蛋白标准品是如何产生的？
A：工业使用的大部分E.coli株以及生物制品生产使用的菌株来源于K12。E.coli宿主细胞蛋白ELISA是根据E.coli的2株K12细菌株提取的可溶性蛋白研发的。我们用自己制备的2种抗体做cross-coverage实验时，发现超过80%有覆盖。换而言之，细菌株1抗体能够检测细菌株2超过80%的宿主细胞蛋白，反之亦然。由于E.coli宿主细胞蛋白的高免疫原性，所以，预计E.coli HCP ELISA能够覆盖大部分E.coli的细菌株。

Q：Rituximab（利妥昔单抗）的商品名是什么？功能是什么？
A：Rituximab的商品名是Rituxan^®（Genetech/罗氏）。它是一个B细胞表面叫做CD20的细胞表面受体的嵌和抗体。可用于治疗淋巴瘤，白血病和自身免疫疾病（鉴定为含有过多B细胞）。

Q：Adalimumab(阿达木单抗)的商品名是什么？功能是什么？
A：Adalimumab的商品名是Humira^®（修美乐）（Abb Vie Inc.）。人源化单抗靶向TNF-alpha，组织TNF受体的激活。TNF-alpha灭活可用于治疗炎症相关的自身免疫疾病。

Q：Palivizumab（帕利珠单抗）的商品名是什么？功能是什么？
A：Palivizumab的商品名是Synagis^® (Medlmmune)。人源化的单抗针对呼吸道合胞体病毒的抗原位点。抑制进入细胞，阻止感染。

Q：Alemtuzumab（阿仑单抗）的商品名是什么？功能是什么？
A：Alemtuzumab的商业名是Campath^®（Sanofi，赛诺菲）是人源化的单抗，靶向是淋巴细胞表面受体CD52。用于治疗慢性淋巴细胞白血病和特定的淋巴瘤。

Q：Cetuximab（西妥昔单抗）的商品名是什么？功能是什么？
A：Cetuximab的商品名是Erbitux^®（百时美施贵宝/礼来和公司/默克集团）。它是嵌合单抗（小鼠/人），抑制表皮生长因子受体（EGFR）。用于治疗转移性结直肠癌和头颈癌。

Q：Trastuzumab(曲妥单抗)的商品名是什么？功能是什么？
A：Trastuzuma的商品名是Herceptin^®（赫塞汀）（Genethch/罗氏）。人源化单抗，靶向是HER2/neu受体。主要是治疗乳腺癌和其他过度表达HER2/neu的肿瘤。

Q：Infliximab（英夫利昔）的商品名是什么？功能是什么？
A：英夫利昔的商品名是Remicake^®(Janssen Biotech公司)。是针对TNF-alpha的嵌合单抗。1998年FDA首次批准用于治疗克罗恩病。接着批准用于治疗牛癣，强制性脊柱炎，关节炎和溃疡性结肠炎。

Q：Bevacizumab（贝伐单抗）的商品名是什么？功能是什么？
A：Bevacizumab的商品名是Avastin^®（Genetech/罗氏）。人源化的单抗，抑制血管内皮生长因子A（VEGF-A）。在美国有限运用于血管抑制剂，FDA批准用于治疗特定的代谢肿瘤。

Q：能否用BioSims™试剂盒定量免疫原性风险？
A：如果发现有差异，则说明与对照参考的单抗有构象偏差，认为在临床研发中是安全的。定量免疫原性风险比较困难。保守说，更多构象偏差会带来更多的免疫原性风险，主要是因为在单抗里面的的典型性表位暴露在外面。免疫系统可以当做外来物质识别，诱导免疫应答。另外一个风险是体内的其他功能性抗体和新发现的表位发生脱靶反应。使用构象ELISA证明与商业化的抗体相比，一些在临床研发中失败的抗体（新抗体，非生物仿制药）有重要的抗原决定簇。现在发现新表位的暴露和临床结果之间有直接联系。这点，是基于有限的单抗测试。

Q：在美国或者欧洲销售的BioSims™Trastuzuma构象ELISA试剂盒的Trastuzumab实际上是否有差异？
A：BioSims™构象ELISA试剂盒，除了ENZ-KIT123，不含有对照参考抗体。必须来自生物仿制药研发者。原因是生物仿制药研发者可能对对照参考抗体的制备方法有差异，可能会影响构象的读数。为了获得有意义的数据，能够比较生物仿制药和生物仿制药的原版，生物仿制药研发者应该知道对照参考抗体的来源并且使用自己的对照。至于使用哪个对照参考抗体，取决于生物仿制药在哪儿研发，将会覆盖什么市场。

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