Protein这个词语来自于希腊语，意思是“第一的物质”。肽及蛋白质对于生命来说正正是“第一的物质”。理所当然地，它的合成方法在化学上一直处于十分重要的地位。

　　现在，将与目的序列蛋白质对应的基因导入到大肠杆菌等宿主中重组表达的基因工程技术十分普及，由此可以生产大量的蛋白质。而且近年，不使用大肠杆菌、只使用酶进行蛋白合成的无细胞蛋白质合成研究也有所进展。

　　但是，使用上述的方法只能合成由20种天然氨基酸组成的单纯的蛋白质，而无法合成出如糖蛋白或磷酸化蛋白等有重要作用的蛋白质。另外，不用特殊方法的话，含非天然氨基酸的蛋白、导入了荧光标记的蛋白等等也无法合成。

　　另外，使用有机合成方法将氨基酸拼接，就能将特殊的氨基酸导入到肽链中。而使用化学合成法的技术已经十分成熟，即使没有大型的设备和熟练的操作人员也是能够合成出肽。

　　所以，在烧瓶内进行氨基酸的连接是化学合成法中最重要的部分，即使这个方法已经有一世纪以上的历史了，但直到现在需要研究的地方还很多。下面简单为大家介绍这个课题以及最近的研究进展。

◆缩合

　　肽合成中最重要的生成氨结合方法已经经过人们的多次研究了，但是主要的问题仍然是消旋化（氨基酸a碳的外延化），它是肽合成中必须要解决的问题。特别在两条或多条长肽链的合成的“片段缩合”中，消旋化问题更为显著。所以无论在固相合成还是液相合成中将氨基酸链伸长，然后将N-保护氨基酸一个接一个地向N端依次序缩合是最常用的方法。

　　近年已经开发出很多能够抑制外消旋化的优秀的缩合剂。例如常用的O- (7- Azaben Zotoriazoru-1-yl) -N, N, N ', N'- tetramethyluroniumHexafluorophosphate (HATU)等在氨基酸的外消旋化外还会发生偶联反应。最近开发出的(1-cyano-2-ethoxy-2-oxo-ethylidene amino oxy) dimethylamino - morpholino - carbeniumhexafluorophosphate（COMU）的效果更优秀，在碎片缩合中也能将外消旋化抑制到最小。

HATU(左)和COMU（右）

　　反应速度也得到了改善，对N-甲基氨基酸和a，a-二烷基酯氨基酸等立体抑制大的氨基酸也有很快的反应速度。另外只需要用水就能除去副产物，使用也十分方便。这些缩合剂的详细情况请参考本杂志的46号（2013年12月号）。

◆NCL法

　　与通常的用残基将氨基酸链延长的方法相比，将一定长度的几条肽链重复结合的方法更加有效率。但是如前述所说，这个方法也必须解决消旋化的问题。而且，侧链上受保护的肽链溶解度会降低，反应点上相遇的概率会降低，从而反应速度降低。如果侧链上没有收到保护的几条肽链能够选择性地和N端或者C端结合的话那是最好不过了，但是事实上所有人都认为这几乎不可能。

　　1994年，Kent等人发表了NCL发，打破了这个我们以往的观点。成为突破口的是半胱氨酸侧链的SH基的特殊反应性。将半胱氨酸和有N末端的肽链、羧酸硫酯反应，然后将两者连结。

　　首先通过硫酯的交换反应，半胱氨酸的SH基发生酰化生成中间体，然后发生SH基的S→N转位得到完整的肽链。通过这个方法就无需使用有可能损伤肽链的酸、碱基、金属试剂，在没有保护的状态下将肽链连结。简单来说，除了基因工程等方法制造处肽及蛋白质之外，还有其他方法将氨基酸链延长。

根据NCL结合生成酰胺

　　即使基因工程也难以合成的糖蛋白质也能够使用本方法合成。例如Bertozzi等人使用这个方法合成出由82个残基组成的一种叫果蝇抗菌肽的抗菌性糖蛋白改变体。糖会和这个肽的第10和第54的苏氨酸残基结合，由于在第25位有半胱氨酸残基，所以这里能使用NCL法。

　　Bertozzi等人首先用分别用不同的固相法合成出第1~24和第25~82的肽。然后用连接剂将第1~24的肽和树脂结合，将肽链伸长后用硫代苯处理，然后C端就会出现硫醇酯的结构。

　　将得到的两个片段在室温下pH7.5的缓冲液中反应18小时，能在得率55%下得到目的肽链。常规的液相法和固相法都难以合成这个大小的片段，使用NCL发能完美实现了。

◆NCL法的扩展

　　NCL法最大的弱点是只能在半胱氨酸残基上进行结合生成。因为有这个限制的存在，所以如果半胱氨酸不在适合的位置或者那些完全不含半胱氨酸的肽或者蛋白质就不适用单纯的NCL法。

　　于是我们开发出半胱氨酸的结构中进行连接，再用雷尼镍处理除去巯基，然后转变成丙氨酸的方法。另外，预先在N端导入青霉胺，然后进行连接，脱硫后转换成缬氨酸的方法。丙氨酸和缬氨酸都是在蛋白质中含量较高的氨基酸，由此可以增大NCL法的适用范围。Danishefsky等人还发明出无须适用金属就可以进行脱硫的方法，可以适用于含有多官能团的肽中。

　　如果需要合成长肽链时，只在一个位置使用NCL法的话会反应不充分，于是我们用以喧噻唑烷羧酸的形式保护N端半胱氨酸，从而进行2阶段的NCL法。用甲氧胺盐酸盐处理喧噻唑烷羧酸后，连接N和S的亚甲基会脱离，半胱氨酸会游离，然后就可以进行另一次的连接反应。

　　C. Unverzagt等人使用连续的连接反应，在有124个残基的肽链中结合了一个由9糖组成的糖链，成功合成出核糖核酸酶C。首先预先用基因转换的方法制作第40~124位对应的肽链，然后用NCL法将用固相法合成出第26~39位的肽（N端是喧噻唑烷羧酸、第34位的冬氨酸有糖链）连接，用甲基胺盐酸盐处理后再将第1~25位的肽连接一次，就会得到目的的糖蛋白。

　　另外，NCL法还有很多使用方法，适用范围会越来越广泛，其他的使用方法请参考总介绍。

◆Bode法

　　Bode等人发明出了与常规方法不同的连接反应。a-酮酸和N-硫酸羟胺混合后，随着水和二氧化碳放出也会生成胺键。

　　Bode法的官能基许容性高，能够和NCL法一样在侧链没有保护的情况下进行偶联反应。另外，将肽的N端胺基氧化成羟胺，也能将C端羧基转换成a-酮羧酸，能够适用与多种基质。

　　完全不使用缩合剂的Bode法在肽合成的历史中也算是划时代的方法。由于副产物只有水和二氧化碳，在活细胞内也能适用，期待今后更多的使用方法。

◆Microflow合成法

　　如NMR和质量分析等，在这几十年间应用于化学上的分析手法取得了很大的进步。另外，进行反应的容器也仍然停留在烧瓶和搅拌机的时代，100多年了也没有得到本质上的改变。但是最近，在这个领域出现了一种叫microflow的方法。

　　Microflow法是在细小的试管型的空间中注入底物或试剂进行混合反应，反应时间能够通过控制混合液的流动的距离来控制。反应容器使用热交换效率高的材料制成，能够精密地控制反应温度。能够将不稳定的反应中间体快速地应用到下个反应中，即使在反应条件要求低温的反应也能在室温下不发生副反应地完成。

　　Microflow法也能用于肽的合成。东工大的布施等人在细试管内用三光气将N-保护氨基酸活性化，和氨基酸酯进行缩合反应。由于在该条件下氨基酸会作为酸盐发生活性化，比常规的反应性更高，消旋化严重。

　　布施等人重新研究了反应条件，在20℃下使用固体光气进行活性化0.5秒后进行4.3秒偶联反应。结果发现，几乎所有底物的消旋化都被控制在1%一下，得率有90%以上。

　　并非使用温和试剂进行长时间反应，而是用强力的活性化法在一瞬间进行反应。固体光气对比其他缩合剂价格更低，废弃物更小。由于flow时间会延长又或者会发生并行反应，所以也可以进行大规模的反应。如果能够实现自动化则将来的应用范围会更加广泛。

　　肽合成有着很长的历史，经过人们的反复研究，技术也得到革新。即使是对有机合成不熟悉的其他领域的研究者也能熟练进行。而且在肽合成领域获得的知识也能用于大部分的有机合成反应中。即使不是肽研究学者，对其他研究者来说这个领域也是很有研究的价值。

◆参考文献

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