◆第1回 何谓ELISA

  ELISA——免疫学检测法之一

　　ELISA是一种使用抗体的免疫学检测法（Immunoassay），命名取Enzyme-linked immune-sorbent assay的首字母，也解释为“酶联免疫吸附测定法““酶免疫检测法”。

　　抗体是生物外来异物抗原进入体内导致免疫反应后生成的蛋白质，属于免疫免疫球蛋白（Ig）。抗体主要包括G（IgG）、M（IgM）、A（IgA）、D（IgD）、E（IgE）五种类型，免疫学检测中主要使用的抗体是IgG。

　　ELISA是利用抗体作为结合试剂的检测方法，这些抗体具有仅与检测物质结合的“优秀的特异性结合能力”及“与极微量检测物质结合具有强亲和性”的特点。

◆ELISA法中如何处理抗体？

　　本文中以使用频率最高的ELISA三明治法为例进行说明，实验选用普通的96孔板。

　　首先，使抗体吸附于孔板表面（称为包被或固相化）。这些抗体被称之为固相化抗体（捕获抗体），用于捕获作为检测对象的抗原。图1所示，仅描绘了吸附1个抗体的情况，实际上还有很多抗体包被在孔板上。在抗体固相化孔板中加入抗原溶液（标准品或检测样品），静置至抗体与抗原结合（一次反应）。反应终止后去除多余溶液并清洗孔板，孔板上仅保留已和固相化抗体结合的抗原。

　　然后加入与固相化抗体识别不同抗原表位的抗体（称为第二抗体或者二抗，检出抗体），放置一会。二抗已经进行了化学酶缀合（标记）的预处理。

　　添加的酶标二抗会识别与固相化抗体结合的抗原，并与之结合。结合后，将多余的酶标二抗冲洗掉。

　　然后加入与标记酶反应的发色物质（显色底物），酶反应发生后，显色底物在酶的作用下会生成色素。

　　最后添加反应终止液终止反应，然后通过96孔板用比色计测定颜色深浅，由此可以测定结合固相化抗体的抗原量。比色定量的结果表现为吸光度，因此标准品的检测结果，以抗原浓度为横轴，吸光度为纵轴，绘制出标准曲线。利用标准曲线通过对检测样品的吸光度的测定从而计算出样品中的抗原量。

图1

　　图1所示的是三明治ELISA法的最基本原理。由于酶分子量非常大，对抗体结合可能会产生空间位阻效应。还难以将多个酶与1分子的抗体结合。

　　因此提出将酶与其他蛋白质结合来减少空间位阻的方法。

　　如下面图2所示，第二抗体用生物素标记。生物素的分子量非常小。生物素是生物体内固有的一种生理活性物质，抗生物素蛋白是存在于卵白中的，可以与生物素强力亲和性结合的蛋白质。酶标记的抗生物素蛋白，可以与抗原结合的生物素标记的二抗反应，从而克服空间位阻。另外随着标记抗生物素蛋白的增加，可以提高信号强度。这种改善方法被应用于ELISA中。

图2

　　这种方法形成“抗体-抗原-抗体”的结构，故而称为三明治法。抗体相当于三明治中的面包，而抗原则是火腿。

◆酶和显色底物

　　ELISA法常用的酶是过氧化物酶，过氧化物酶是以过氧化氢等为底物，催化氧化反应的酶。过氧化物酶有几种，本文表1概括了HRP即Horseradish来源的过氧化物酶的主要性质。

　　这里需注意样品可能存在的抑制剂。如表1所示，过氧化物酶的抑制剂有CN^-、S^2-、F^-、N^3-等。特别值得注意的是取血液样品时，使用氟或NaN₃涂层的采血管。ELISA法中检体与抗体反应后要进行清洗，因此抑制剂不会对酶活性起决定性的抑制作用，但清洗后残留的抑制剂将酶抑制到一定程度时，会出现显色度降低的可能性。因此，实验中最好不要使用上述这些采血管。

　　HRP的显色底物是被叫做TMB的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（3,3,5,5’-Tetramethyl benzidine）。HRP分解过氧化氢，生成的活性氧使TMB氧化。在所得的蓝紫色溶液中加入硫酸作为反应终止液，在硫酸的氧化下，蓝紫色会变黄色，并测定在450nm处的吸光度。

 表1

◆吸光度的测定

　　测定在450nm处TMB来源色素的吸光度。为了消除孔板的均一性和划痕等的影响，测定副波长620nm（600-650nm）的吸光度，与450nm的吸光度的差作为真实吸光度。

　　所谓吸光度就是由表示比色定量基础的光透过率和溶液中物质浓度关系的朗伯比尔定律（Lambert-Beer’s low）决定的数值。

　　吸光度=log10（Io/I）=εlc

　　Io：入射光；I：透射光；ε：摩尔吸光系数；I：吸收层（cm）；c：浓度（M）

　　透射光与入射光的比率，即透光率的倒数的对数即为吸光度。

　　例如，透光率为10%时，吸光度即为100/10=10，log10=1。透光率为50%时，吸光度为100/50=2，log2=0.301。吸光度3.0时透光度为0.1%。根据读板机的功能，建议检测前确认仪器测定的极限值。

表2

下回将发布《第2回 ELISA的操作方法及其要点（前篇）》！

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