◆关于试剂盒

是否需要特殊设备才能使用INDIGO的检测试剂盒？

INDIGO检测试剂盒所需的设备和材料是大多数实验室中的常用器材。

具体来说，您需要准备的器材包括：

第1天：

· 生物安全柜

· 37°C，加湿，5%CO₂培养箱，用于哺乳动物细胞培养

· 37℃水浴设备

· 70%酒精湿巾

· 8或12道电子移液枪和灭菌枪头

· 一次性无菌培养皿

· 无菌多孔培养皿，或深孔板，或适合的类似容器，用于进行对照化合物和待测化合物的梯度稀释

· 可选：拮抗剂对照化合物

· 可选：透明96孔检测板，无菌，可用于细胞培养，用于在第2天细胞检测

第2天：

· 微孔板分光光度计

INDIGO的核受体检测试剂盒可以用于诊断目的吗？

INDIGO的试剂盒仅用于研究用途，不用于人类的诊断或治疗用途。

1×96孔和3×32孔的检测规格有什么区别？

INDIGO的1×96孔检测试剂盒包含在单个96孔检测板中进行检测的试剂。3×32孔检测试剂盒包含可在96孔板格式中进行三组检测的试剂。每组试可进行32次检测。但是，如果需要，可以组合试剂以进行64或96次测定。请注意，报告细胞的等分试剂只作为一次性试剂提供。一旦解冻，报告细胞不能再次冷冻或维持在培养基中，以期进行下游检测。因此，在检测后，应将剩余的试剂弃置。

检测试剂盒的阳性核受体激活的准确值为？

经我们研究发现，符合我们研究记录并具有数学意义的值为2倍。

使核受体数据可靠的细胞活力的准确值为？

细胞减少15%下具有统计学意义。

INDIGO试剂盒是否使用胎牛血清？

几乎所有INDIGO试剂盒中包含的化合物筛选培养基（CSM）都含有10%的活性炭处理胎牛血清（FBS）（RORg检测试剂盒（5%）和TGF-β（2%）除外）。如果您的待测物质是人血清，我们建议您使用无血清培养基，我们可提供该培养基，详情请在订购时向我们咨询。

应该使用何种波长来进行检测？

INDIGO的检测基于发光，而非荧光。因此，在发光模式下读取时，无需指定特定波长（或任何类型的滤镜）。最终仪器会检测总光子发射量。

是否可以将待测化合物接种到孔中，然后等细胞解冻后立即加入细胞？

按照检测方法，将化合物添加到细胞中更为合理。

INDIGO报告基因检测可以接受多少浓度的有机溶剂进入检测孔？

检测孔中有机溶剂的浓度不应超过0.1%。我们建议检测孔中残留的DMSO不超过0.4%。

复合筛选培养基（CSM）和细胞恢复培养基（CRM）在初次解冻后可以重复使用吗？（3×32孔检测试剂盒专有）

CSM/CRM可以在两次使用之间解冻并冷藏保存。但是，我们建议仅将其在4°C下保存一周以内，超过此时间的任何场合都应重新冷冻。

我可以解冻并重新冷冻你们LCMA试剂盒中提供的4 mM Staurosporine吗？

是的，我们建议将其保存在-20℃。

可以解冻并重新冷冻LCMA缓冲液和LCMA底物吗？

是的，您可以解冻LCMA缓冲液并将其保存在4℃。可以冷冻/解冻LCMA底物最多3次。

可以在进行检测之前使用台盼蓝检查细胞活力（QA）吗？

我们不建议使用台盼蓝来检查细胞活力，因为对于刚从解冻创伤中恢复的细胞，台盼蓝可能无法准确评估细胞活力。

产品是如何运输的？

INDIGO的所有检测试剂盒均采用干冰运输。试剂盒的不同组分可以在其各自标签上标明的温度下储存，或将整个试剂储存在-80°C下。为了确保最大的活力，报告细胞必须保持在-80°C直到使用前。产品失效日期印在每个套件随附的产品认证说明书（PQI）上。

◆其他常见问题

INDIGO的检测是结合检测（Binding Assay），或提供结合检测？

INDIGO的检测不是结合检测。它是基于细胞的反式激活检测，主要用于筛选待测样品以量化化合物可能对核受体发挥的任何功能活性，无论是激动剂还是拮抗剂。INDIGO报告系统利用萤火虫萤光素酶报告基因技术，虽然该过程发生了结合，但我们的分析并不检测结合。相反，其测量与受体激活状态（激活或抑制）相关的荧光素酶的光响应。量化处理过的报告细胞中荧光素酶表达的变化为受体活性变化提供了另一种灵敏的测量方式。它通过发出的光水平告知科学家受体与药物相互作用的含义（强度）。此外，基于细胞的检测更灵敏，能够检测到较小水平的激活。

INDIGO使用何种细胞系/细胞类型？

INDIGO的核受体检测试产品利用经过改造的专有的人类和非人类哺乳动物细胞来提供高水平表达的指定受体。每个试剂盒的特定的细胞类型信息是专有的，在购买检测试剂盒后可与INDIGO技术团队或中国独家代理富士胶片和光联系获得。

INDIGO的核受体检测试剂盒是否表达天然的全长受体？

INIDIGO的类固醇激素核受体检测试剂盒（ERα、ERβ、AR、PGR、MR、GR）中包含的报告细胞可表达天然的全长受体。然而，INDIGO的其他核受体检测试剂盒的报告细胞表达的是混合的核受体。在该情况下，包含DNA结合域（DBD）的各个受体的天然N端序列已被酵母编码的Gal4-DBD序列替换。所有其他天然核受体功能/结构域（配体结合域、铰链区和各种激活域）都存在于这些混合受体中。这些报告细胞还包含萤火虫荧光素酶报告基因，该基因在功能上与Gal4的上游遗传效应元件有关。因此，一旦生物活性化合物与混合受体的配体结合域结合，仅诱导荧光素酶报告基因。混合受体的配体激活不会诱导靶基因的附带性表达，因为这些基因只由天然核受体调节。

受体检测试剂盒中的对照激动剂/拮抗剂是？

欢迎向我们咨询对照化合物列表。INDIGO在检测试剂盒中采用了商品化的对照激动剂，并且每个检测试剂盒中都包含这种对照激动剂。部分实验中采用了已知且商品化的对照拮抗剂，但部分拮抗剂检测试剂盒中暂无可用的对照拮抗剂提供。

将数据标准化（例如，细胞数、蛋白含量）的最佳方法是？

我们不会也不推荐将RLU数据标准化为细胞数或蛋白含量。报告细胞悬浮液是一种“主试剂”，以高精度分配到检测板的所有孔中。细胞数量或健康状况的任何显着下游变化，将是待测化合物处理诱导细胞毒性的结果。以拮抗剂模式分析（和反向激动剂模式分析）进行细胞毒性分析以识别和剔除假阳性数据十分重要，而INDIGO的活细胞多重分析（Live Cell Multiplex，LCM）正正非常适合此目的。然而，试图将进行过处理的、处于代谢危象的细胞的RLU数据，标准化为未经处理的健康对照细胞可能会造成对数据的严重误解。在进行基于细胞的反式激活检测（依赖于基因诱导、转录、翻译、mRNA和蛋白转换的协调细胞周期过程）时，“健康细胞”和“死亡细胞”不是相同的单位，因此尝试将检测数据标准化为任何与细胞相关的结果都不是一种合理的方法。

什么是反向激动剂核受体检测？这些检测是否在“激动剂”和“反向激动剂”模式下分别进行？

几种表达出高水平固有活性的核受体，（似乎）独立于配体的相互作用。ROR、ERR、CAR-1和LRH-1都是具有这种活性特征的核受体，它们被泛称为“反向激动剂受体/检测”。然而，在实际中，当生物活性化合物与受体的配体结合域结合时，将可能出现两种功能结果：（1）受体的固有活性将会出现剂量依赖性降低（反向激动剂反应），或（2）在受体已经很高的固有活性水平（激动剂反应）上，活性会出现适度的剂量依赖性增加。INDIGO的检测产品能够在单次常规检测中可显示这两种结果。

INDIGO的“反向激动剂”受体检测（RORα、RORγ、ERRα、ERRγ、CAR-1和LRH-1）能否设定为抑制受体的高固有活性，从而评估激动剂活性？

可以的。当寻找激动剂反应时，通过使用试剂盒提供的固定浓度的反向激动剂对照化合物来抑制受体的固有活性是一种常见的策略。例如，筛选RORγ激动剂的研究人员经常使用这种策略。用固定浓度的熊果酸（INDIGO的对照反向激动剂）和不同浓度的待测化合物对RORγ报告细胞处理。作为RORγ的推定激动剂的化合物，将显示出高于RORγ活性抑制水平的显著的剂量依赖性的增加。

INDIGO的核受体检测能否用于测试来自废水处理样品、环境样品、植物样品等经处理的提取物？

可以的。待测样品更倾向于为符合以下要求的水性制剂（1）无颗粒物质的均质溶液；（2）无菌。如果不符合任一要求，样品应通过0.2μm针头过滤器过滤。水性制剂的浓度应不低于4倍检测中的最终处理浓度。如果提取物使用DMSO制备，则需要不少于250倍浓缩（最好更浓缩）的储备液。残留在任何INDIGO核受体检测中的DMSO不得超过0.4%。较高的DMSO浓度会使检测性能降低。