◆Western Blotting实验失败缘由？
Western Blotting是生命科学研究的基础实验方法，实验中的蛋白量、抗体、凝胶、膜和检测反应等因素均可能导致实验失败，但初学者往往不知道原因所在。 “我不知道Western Blotting失败的原因是什么“ “我想知道解决方案！“ 针对Western Blotting的各种问题，本文整理了在转膜、抗体反应、检测等过程中的常见问题及解决方案。 |
|
以下为Western Blotting常见的失败案例：
● 高背景
● 出现漫反射带
● 转膜不均匀
下面将分别介绍它们的原因及相应的解决方案。
高背景
原因 | 解决方案 |
洗涤不充分 | ● 增加洗涤次数 ● 增加洗液体积 ● 延长洗涤时间 ● 确认Tween® 20 (*)浓度 |
无法阻断非特异性结合 | ● 重新调节封闭温度和时间。室温下1 h，4℃下过夜 ● 添加Tween® 20 (*) ● 使用添加Tween® 20 (*)的封闭缓冲液（TBS-T、PBS-T） ● 使用高灵敏度发光试剂（Immunostar® 系列） |
膜处理不当 | ● 对膜进行必要的前处理 ● 使用干净的镊子和手套，注意不要损坏膜。 ● 孵育时振荡 ● 使用低背景且可高灵敏度检测靶蛋白的CLEARTRANS® 系列产品 |
● 充分清洗转膜装置、电泳槽等设备，操作过程中佩戴手套 | |
强化学发光信号 | ● 缩短检测的曝光时间 ● 缩短检测试剂的反应时间 ● 降低检测试剂的浓度 |
(*) ICI Americans社的注册商标
出现微笑条带和扭曲条带
原因 | 解決方案 |
● 降低电压进行电泳 | |
盐浓度不同 | ● 盐浓度越高，移动速度越快，需统一样品的盐浓度 |
上样量不同 | ● 统一各个孔的上样量 |
有空孔 | ● 在空孔中上样相同盐浓度、相同液量的样品，或仅上样样品缓冲液 |
出现漫反射带
| 原因 | 解决方案 |
| 受到样品溶液中变性剂和表面活性剂的影响 | ● 确认样品的提取和制备过程 |
| 样品存放时间久，存储方法不当，导致蛋白降解 | ● 确认样品的制备时间和存储方法 |
| 转膜时间过短 | ● 如果所有条带出现相同现象，可能是转膜时间短，需要延长转膜时间 |
| 蛋白量过高 | ● 调整蛋白上样量和浓度 |
转膜不均匀
原因 | 解决方案 |
凝胶和膜之间有气泡 | ● 使用滚筒等去除气泡 |
转膜设备的问题 | ● 使用半干式设备时，反复使用会导致转膜板弯曲，建议返厂维修或更换新的设备 |
转膜方法的问题 | ● 半干式设备容易引起转膜不均匀的问题，可尝试更换为湿转仪 |
◆其他失败案例的原因及解决方案
● 条带模糊、不清晰
● 条带空白
● 信号弱、无信号
● 背景有斑点和污渍
● 丽春红染色效果差
下面将分别介绍它们的原因及相应的解决方案。
条带模糊、不清晰
解決方案 | |
蛋白量过高 | ● 降低电泳的蛋白量 |
抗体浓度高 | ● 降低一抗、二抗的浓度 |
检测信号高 | ● 缩短曝光时间 ● 缩短检测试剂的反应时间，反应后尽可能去除试剂 ● 降低二抗浓度 |
条带空白
解決方案 | |
蛋白量高 | ● 减少蛋白量 |
抗体浓度高 | ● 降低一抗、二抗的浓度 |
信号弱、无信号
解決方案 | |
抗体失活 | ● 检查抗体存储状态，时间 ● 重新进行抗体反应时，推荐使用10 min即可去除抗体的“WB膜再生液“ |
抗体结合力不足 | ● 确认抗体的稀释浓度是否合适 ● 延长抗体反应时间 ● 对于低蛋白表达量的样品，可增加电泳量，提高抗体浓度 ● 使用抗原抗体反应促进试剂 ● 更换高效转膜缓冲液 |
叠氮化钠抑制酶反应 | ● 叠氮化钠会抑制HRP的活性，因此抗体中含叠氮化钠时，需要稀释抗体以降低叠氮化钠 浓度或使用不含叠氮化钠的抗体 ● 使用HRP标记一抗且阻断剂中含有叠氮化钠时，需在封闭后使用 TBS-T清洗再进行抗体 反应 |
曝光时间短 | ● 延长曝光时间 |
封闭时间不当 | ● 封闭时间过长时，封闭剂会遮盖抗原，降低抗体反应性，因此需要确认封闭时间是否合适 |
转膜效率低，无法转膜 | ● 延长转膜时间 ● 靶蛋白的分子量较高时(例：100 kD以上)，添加0.1%的SDS(十二烷基硫酸钠) ● 使用预染蛋白Marker作为阳性对照，确认转膜效率 ● 使用具有抗体结合位点的分子量Marker作为阳性对照 |
检测试剂的化学发光弱 | ● 确认检测试剂是否变质 ● 使用高灵敏度的发光试剂“ImmunoStar®系列“ |
背景可见斑点和污渍
解决方案 | |
镊子被污染 | ● 镊子上的污垢会附着在膜上形成背景。需使用经乙醇消毒后的干净镊子夹住膜的边缘 |
洗涤不充分 | ● 增加洗涤次数和洗液体积 |
抗体反应不当 | ● 增加抗体反应溶液，并振荡使其反应 |
检测设备被污染 | ● 检测前，使用乙醇擦拭放置膜的样品台，去除污垢 |
丽春红染色效果差
原因 | 解决方案 |
蛋白未转膜 | ● 确认转膜设备是否正确运行 ● 确认膜和凝胶是否正确接触 |
低蛋白量 | ● 增加蛋白的上样量 |
染色试剂变质 | ● 检查染色试剂的有效期 ● 更换凝胶染色试剂（Negative Gel Stain MS Kit、Ponceau 3R、Ponceau-3R Stain Solution、Amido Black 10B） |
◆Western blotting必备产品
● 封闭用脱脂奶粉 ● 高效转膜液 ● WB专用膜 |
|
● Rasheed Sule. et al. : Future Science., 75, 99 (2023)
● Habeebunnisa Begum. et al. : Future Science., 73, 58 (2022)
● 岡田雅人, 三木裕明, 宮崎香：「無敵のバイオテクにカルシリーズ 改訂第4版 タンパク質実験ノート 下」p.44 (羊土社)
● 西方敬人：「バイオ実験イラストレイテッド⑤」p.165 (秀潤社)
| 免责声明 |
|
1. 本公司密切关注本网站发布的内容，但不保证发布内容的准确性、完整性、可靠性和最新性等。 2. 本公司不保证使用本网站期间不会出现故障或计算机病毒污染的风险。 3. 无论何种原因，使用本网站时给用户或第三方造成的任何不利或损害，本公司概不负责。此外，对于用户与其他用户或第三方之间因本网站发生的任何交易、通讯 3. 或纠纷，本公司概不负责。 4. 本网站可提供的所有产品和服务均不得用于人体或动物的临床诊断或治疗，仅可用于科研等非医疗目的。如任何用户将本网站提供的产品和服务用于临床诊断或治 4. 疗，以及其他特定的用途或行为，本公司概不保证其安全性和有效性，并且不负任何相关的法律责任。 |
