细胞培养是分子生物学和细胞生物学中使用的主要技术，在细胞增殖、功能分析、分化和信号传达等的机制研究中尤为重要。此外，生产抗体药和疫苗等的生物药和再生医疗（细胞治疗）领域用的细胞制剂时也会使用。

FUJIFILM Wako可提供细胞培养实验所需的培养基、血清或添加剂、细胞分散液、细胞保存液、支架和培养容器/器材等，请根据培养细胞和使用用途进行选择。

◆什么是细胞培养？

细胞培养是指动植物等生物组织中分离的细胞在试管内（in vitro）进行增殖和维持的过程。生物体外培养的细胞称为培养细胞。与生物体相比，可以使用更单纯的系统处理细胞，分析不同环境变化下的细胞响应。

细胞可直接从生物组织中采集，培养前使用酶等进行分离（原代培养细胞），或使用已建立的细胞株和细胞种类。

原代培养细胞

原代培养细胞是指从动植物组织中直接采集并进行培养的细胞。不仅有单一的细胞类型，还有多个细胞类型，可研究复杂的细胞间相互作用。

例如：肝脏的原代培养细胞有肝细胞、肝单核细胞、库普弗细胞等。

细胞株

细胞株是原代培养细胞传代并增殖的细胞。在生物体中丧失了结构和功能的细胞，需要维持特定性质（基因型、表达型等），形成稳定的增殖状态。与正常的细胞相比，增殖速度块，细胞集落形成率高，自律性丰富。此外，培养中还可能会恶化，显示与癌细胞相同的特征。这使其培养非常容易，在实验中使用也非常方便。

例如：CHO细胞、HEK293细胞、癌细胞等

细胞种类

细胞种类是指比细胞株更平均的细胞群，具有特异性更高的性质和功能。

例如：显示特定药物耐性的细胞等。

培养条件：细胞培养中的重要要素

在细胞培养中，培养条件是细胞的生存和增殖中必不可少的。根据细胞的种类需要不同的培养条件，主要的要素有以下几点：

● 培养基

● 培养容器/器材

● pH

● 温度

● 气体（二氧化碳、氧气）

● 其他的物理要素（渗透压、光、已灭菌的环境）

培养基

培养基可提供氨基酸、碳水化合物、矿物质、维生素、生长因子等细胞增殖所需的营养素。

需根据培养细胞的种类和目的选择合适的培养基。以下是根据生物种类和目的整理的培养基。

此外，细胞大部分都需要支架，若不是与个体或半固体的底物粘附的状态则无法增殖。但是，部分细胞可通过悬浮使其增殖。

◆培养容器/器材

细胞培养容器的尺寸和形状会直接影响实验数据的再现性。其作用是为了防止污染或作为贴壁细胞的支架等，为提供合适的培养环境发挥重要作用。

FUJIFILM Wako可提供通用型培养容器、共培养容器、特殊培养容器。

pH值

大部分细胞喜欢的pH值范围在7.2~7.4，根据细胞的种类和培养条件，所需的pH值各异。若pH值设置错误，可能会导致污染或抑制增殖，所以选择合适的pH值范围非常重要。

温度

哺乳类细胞的适宜温度为36-37°C，昆虫细胞的适宜温度为27°C，由于根据培养细胞的种类适宜的温度不同，所以需根据实际条件设定合适的温度。

气体

氧气（O₂）和二氧化碳（CO₂）的浓度设定尤为重要。一般培养中常用5-20%的氧气浓度，5-10%的二氧化碳浓度。

其他的物理要素

渗透压、光和已灭菌的环境等会影响细胞的增殖和生存。

若想要稳定温度、湿度和CO₂浓度，一般可使用CO₂孵育箱。

CO₂孵育箱

CO₂孵育箱是指具有可控制恒温槽内CO₂浓度功能的孵育箱。普通使用培养皿等的开放系统进行的培养中，需将细胞放入CO₂孵育箱内。这是因为需要将培养基的pH值调整至7.2-7.4的生理性范围内。

保持温度在37°C的环境中，培养基中所含的NaHCO₃会释放CO₂，导致Na₂CO₃残留，pH值上升。与此相对，在一定压力下添加CO₂气体可降低pH值进行调整。另一方面，在密封的锥形瓶等的密闭系统中进行培养时，为了能像在空气下进行培养，需使用调整了NaHCO₃浓度的培养基。

◆细胞的冻存

若长时间培养细胞可能会导致基因变异，这时可通过冻存，防止因传代导致的细胞损伤或因老化导致的细胞损失。

动物细胞内含有大量的水分，若直接冷冻培养基中的培养细胞，细胞内外的水分会结晶化导致细胞器和细胞膜等的细胞结构受损，细胞复苏后细胞无法生存。因此，选择合适的冻存方法防止细胞内外形成冰晶，防止细胞组织的物理性损伤非常重要。

培养细胞的冻存方法有急速冷冻法和慢速冷冻法。

急速冷冻法是指将细胞浸入含有甘油和乙二醇等抗冻剂的冻存液中，然后使用液氮快速冷冻的方法。常用于冻存人ES/iPS细胞和胚胎细胞等。

慢速冷冻法是指添加冻存液（甘油或DMSO），使用程序冷冻器或泡沫箱等容器缓慢冷冻的方法。用于冻存所有动物细胞。

【冻存所需的试剂盒器材】

● 细胞冻存液

● 冻存管

● 超低温冷冻仪

● 断热容器（泡沫箱等）

● 液氮罐

◆培养细胞的形状和性质

培养细胞根据形状和性质大致可分为“悬浮细胞”和“贴壁细胞”两种。

悬浮细胞和贴壁细胞

培养细胞从组织中分离后会反应其性质。生物体内血液中的细胞为悬浮状态培养，粘附于组织的细胞以贴壁状态培养。将其称为悬浮培养和贴壁培养。

悬浮细胞例：淋巴细胞、白细胞等

贴壁细胞例：上皮系细胞（endothelial cell）、成纤维系细胞（fibroblast）、神经芽系细胞（neuronal cell）等。

悬浮培养

血液细胞，尤其是淋巴细胞来源细胞使用常规培养条件无法贴壁于培养器材，会在悬浮状态下增殖。悬浮培养常用培养皿进行，但是培养大量细胞时需搅拌培养基，为此开发了各种各样的培养器材。

贴壁培养

大部分成纤维样细胞和上皮样细胞在培养系统中总会·粘附于底物，而且不贴壁就无法增殖。作为例外，癌细胞和长期培养的正常细胞中也有在悬浮状态下增殖的细胞。转移至培养系统后会贴壁培养器材，形成单层并伸展和增殖。

◆细胞的原代培养和传代培养

原代培养

原代培养是指从生物体组织中采集细胞，分散后，首次接种并进行培养。

传代培养

传代培养是指剥离或分散培养细胞后，转移至新的培养容器进行增殖和维持。大部分贴壁细胞在传代时需使用细胞分散/剥离试剂解离细胞和细胞间或细胞和器材间的粘附。

传代时机

细胞会像右图所画的增殖曲线进行增殖。停滞期活动对数增殖期初期的细胞数较少，不适合传代.稳定期以后的状态根据细胞的种类和培养条件各异，为了维持稳定的状态，需在对数增殖期后期进行细胞传代。

◆细胞培养中污染的原因和对策

污染是指在培养过程中混入了原来想要培养的细胞以外的生物因子。

污染的原因主要分为以下三点：

● 微生物导致的污染

● 支原体、病毒导致的污染

● 其他哺乳类细胞导致的污染

如何防止污染

● 实验操作决定顺序后再进行

● 不将成为污染源的物质带入洁净室

按照决定的顺序进行实验操作，可以简单确认污染的原因，进行适当的处理。

此外，不要将成为污染源的物质带入洁净室，保持清洁的状态非常重要。

◆参考文献

1. 井出利憲, 田原栄俊 著：「無敵のバイオテクニカルシリーズ　改訂　細胞培養入門ノート」 (羊土社) (2010).

2. 黒木登志夫, 許南浩 編：「実験医学別冊　培養細胞実験ハンドブック」 (羊土社) (2004).

3. 許南浩 編：「細胞培養なるほどQ&A」 (羊土社) (2003).

4. 中村幸夫：「目的別で選べる細胞培養プロトコール」(羊土社)(2012)

5. 柿木 章伸：「細胞培養」(Equilibrium Research)(2008)

6. 小山秀機 編：「細胞培養ラボマニュアル」(シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社)(1999).

7. 社団法人生化学会 編：「細胞培養技術」(株式会社東京化学同人)(1990)