蛋白聚集小体检测试剂盒
PROTEOSTAT® Aggresome detection kit
◆原理
聚集小体（Aggresome）是由一群不正常堆叠在一起的蛋白质所形成的包涵体（Inclusion Bodies）。聚集小体的出现往往也表明细胞正处于某种应激状态，比如高温、病毒感染、活性氧自由基攻击等。聚集体通常是响应细胞应激而形成，并通过分离错误折叠的蛋白质提供细胞保护机制，最终导致它们被自噬清除。此外，蛋白质聚集体的形成是多种人类疾病的标志，例如阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、肌萎缩侧索硬化症或酒精性肝病。
PROTEOSTAT® Aggresome detection kit中包含的 PROTEOSTAT® 是一种分子转子染料，在溶液中沿着单个中心键的自由分子内旋转可防止荧光产生。当它特异地插入到错误折叠和聚集的蛋白中的交叉β-sheet四级结构中，旋转受到抑制并导致发出强烈的荧光。
PROTEOSTAT® 聚集小体检测试剂盒提供了一种快速、特异、定量的方法来标记细胞中的聚集小体，且无需进行人工蛋白定点突变。PROTEOSTAT® 染料已在广泛的条件下对多种小分子调节剂进行验证，适用于具有治疗价值的化学物的筛选。此外，本试剂盒还适用于多重免疫荧光，以在自噬和聚集体形成的背景下研究您的目标分子。
◆试剂盒组成
组分 | 包装 |
PROTEOSTAT® Aggresome Detection Reagent | 10 μL |
Hoechst 33342 Nuclear Stain | 50 μL |
Proteasome Inhibitor (MG-132) | 120 nM |
10×Assay Buffer | 25 mL |
◆特点
● 提供基于细胞的灵敏的药物反应性测定，以在真实的细胞环境中识别与神经退行性疾病相关的抑制剂
● 可靠且简单的检测，不需要非生理性蛋白质突变或基因工程细胞系
● 作用条件广泛，适用于筛选具有潜在治疗价值的小分子化合物
● 已进行优化以兼容免疫染色
● 可通过流式细胞术轻松量化聚集体和相关包涵体
● 可用于神经退行性疾病、肝病、毒理学研究等的研究
◆案例・应用
■ 应用实例 1：流式细胞术检测聚集小体
流式细胞术的分析：Jurkat细胞在37°C下用 0.2% DMSO对照或用5 µM MG-132诱导过夜。处理后，将细胞固定并与PROTEOSTAT® 染料一起孵育，无需洗涤即通过流式细胞术在FL3通道中使用488 nm激光进行分析。在 MG-132处理的细胞中，红色荧光信号增加约3倍。所描述的测定允许评估蛋白质聚集的影响。
■ 应用实例 2：PROTEOSTAT® 染料与荧光染料的应用
荧光显微镜：含有蛋白聚集体的HeLa细胞，用 5 µM MG-132蛋白酶体抑制剂（右）处理12小时，通过 PROTEOSTAT®（红色）检测并用Hoechst 33342复染。左侧的为未经处理的对照。
荧光显微镜：含有蛋白聚集体的HeLa细胞，用 5μM MG-132蛋白酶体抑制剂处理12小时，通过PROTEOSTAT® 聚集体染料（左上）检测，显示与荧光素-p62抗体（右上）和复合图像（中下）的共定位
■ 应用实例 3：不同搅拌速率对蛋白聚集的影响
使用本产品检测后，可知搅拌速度越快，蛋白聚集程度越大。
■ 应用实例 4：蛋氨酸氧化可抑制蛋白聚集
蓝色曲线为对照，没有搅拌；在搅拌速度在300 rpm下， 绿色曲线与红色曲线分别表示蛋氨酸被氧化后的蛋白聚集情况。
使用本产品检测后，可知蛋氨酸被氧化后可抑制蛋白聚集。
■ 应用实例 5 ：内质网应激相关细胞自噬产生蛋白聚集小体
分别25，50，75 mmCQ，100 nM的thapsigargin（TG）或5mM的MG-132处理K562细胞24小时。然后在温室下用PROTEOSTAT® （1：10,000）固定并透化细胞30min。接着在BD流式细胞仪LSR II的蓝色610/20 nm的通道分析细胞（30,000）。
图片来源：Courtesy of the Flow Cytometry Core Facility, Blizard Institute, Queen Mary University of London, London, UK.
■ 应用实例 6
K562 细胞分别使用Thapsigargin (Tg, 0.1 µM)、25、50 和 75 µM 氯喹 (CQ) 用试剂处理以诱导内质网应激和不完全自噬 24 h。使用蛋白酶体抑制剂 MG-132 (5 µM) 作为阳性对照处理24 h。将沉淀的细胞固定并透化。然后，根据制造商的说明，使用 300 µL PROTEOSTAT® 和 1 µg/mL DAPI（用于细胞周期测定）在室温下标记细胞30min。确定每个处理的S期的 Aggresome 倾向因子 (APF) 高于G1和高于S期的G2m的相对增加，并与对照值进行比较。与对照组相比，ER 应激诱导剂、Tg 和 50 µM CQ在S期比G1更能引起蛋白聚集体上调，但蛋白酶体抑制剂 MG-132 和 50 µM CQ 在 G2m 期比S期更显著地下调聚集体。
图片来源：Courtesy of the Flow Cytometry Core Facility, Blizard Institute, Queen Mary University of London, London, UK.
PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测试剂盒 Q&A
1．Q： PROTEOSTAT® 热稳定检测试剂盒（ENZ-51027），蛋白聚集检测试剂盒（ENZ-51023）
1．Q： 和PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测试剂盒（ENZ-51035）的区别？
1．A： 1）PROTEOSTAT®染料属于分子轮子染料（molecular rotor dye）。在溶液状态不发荧光（由于在中心的碳-碳单键周围的自由转动，
分离了探针的不同芳香部分）。由于分子轮子染料接触到蛋白聚集体后，会封闭进入原纤维，形成β折叠，具有高强度荧光。类似于
染核酸碱基的EB 一样。
1．A： 2）PROTEOSTAT® 热稳定检测试剂盒（ENZ-51027）用于直接监测热诱导蛋白变性引起的蛋白聚集，不检测蛋白非折叠而暴露的疏
水部分。该试剂盒用于检测蛋白缓冲液，其他添加成分对蛋白稳定性的影响，在特定条件下多少温度时蛋白会聚集。
1． A 3）蛋白聚集检测试剂盒（ENZ-51023）用于检测液体状蛋白或者多肽形成聚集的情况。可用于确认蛋白保存的最优形态，筛选促进或
者抑制蛋白聚集的试剂，检测分子伴侣的活性。与标准品或者已知浓度样品一起使用，可定量检测蛋白聚集。
1． A 4）PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测试剂盒（ENZ-51035）检测变性蛋白，包括活细胞内聚集体或者聚集体样包涵体。PROTEOSTAT®
蛋白聚集检测染料在聚集小体形成时，接触到聚集蛋白时会变的更明亮，可用流式或者荧光显微镜检测。
２．Q： 使用ENZ-51035 时，是否可以终止并在在40℃过夜保存，第二天继续实验？
A： 建议可以在加染料前终止。荧光强度在液体中会成倍降低。而且染料与蛋白长时间孵育后，会影响蛋白聚集。
３．Q： 阳性对照染色不好。
A： 染料没有避光保存。染色时候没有避光，需要染色后立即检测。聚集蛋白不是液体。延长离心会使聚集蛋白沉淀。不要离心聚集蛋
白（样品或者对照）。
４．Q： 蛋白信号饱和。
A： 蛋白样品的浓度很高。用1×Assay Buffer 稀释样品。
５．Q： 阴性对照观察到高荧光强度。
A： 样品含有干扰物质。该试剂可以与常规使用的缓冲液(PBS,Tris,HEPES)和赋形剂（海藻糖和蔗糖）使用，不过不要使用高浓度的吐温
20（比如：0.2%）
６．Q： 蛋白与PROTEOSTAT® 检测试剂结合是否是可逆的？
A： PROTEOSTAT® 检测试剂与聚集蛋白的相互作用是非供价结合。所以，理论上是可逆的。但是我们没有尝试将染料从样品中去除。
７．Q： 在药物应激检测中，细胞是否可以经胰酶消化后去检测细胞中的蛋白聚集？
A： 胰酶可以与PROTEOSTAT® 聚集检测试剂盒配套使用。细胞消化后，表面活性剂加入给细胞打孔。更大的聚集体仍然是不溶的，可
以通过离心沉淀。小的聚集体通过超滤分离。表面活性剂，膜和可溶蛋白可洗掉，PROTEOSTAT® 检测试剂可用于残留蛋白。
８．Q： 在研究细胞蛋白聚集时，如何设置阳性对照？
A： MG 132 处理的细胞可作为阳性对照。
９．Q： 细胞裂解液是否可用PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测试剂检测？
A： 检测细胞裂解液是有挑战的，表面活性剂会引起高背景。可以过滤去除表面活性剂。更大的聚集体仍然是不可溶的，可以通过
离心沉淀。小的聚集体通过超滤分离。表面活性剂，膜和可溶蛋白可洗掉，PROTEOSTAT® 检测试剂可用于残留蛋白。
１０．Q： PROTEOSTAT® 染料是否可以检测~300kDa 的蛋白二聚体？
A： PROTEOSTAT® 可以检测从单体到二聚体转变的蛋白，结合分子筛层析法。但是信号会变的更强烈，因为聚集体更大。
１１．Q： 如果样品稀释到低浓度（比如0.5mg/mL）是否会改变聚集蛋白的百分比含量？
A： 聚集蛋白的百分比（聚集蛋白占总蛋白的比例）将保持不变。聚集蛋白的浓度会降低，信号也会减弱。
A： 如果用未聚集蛋白稀释样品，聚体蛋白的百分比会变化。
１２．Q： PROTEOSTAT® 试剂盒是否可用于研究原核细胞样品的蛋白聚集？
A： 如果膜部分去除的话，是可以检测原核细胞的。如果膜没有分离，染料会聚集在膜上，引起高背景值。
１３．Q： PROTEOSTAT® 是否可检测革兰氏阴性菌的蛋白聚集？
A： 革兰氏阴性菌外层膜的脂多糖会影响。操作手册中提到的打孔缓冲液将移除大多数细菌的内层膜，破坏革兰氏阴性菌的外层膜。所以
可以观察革兰氏阴性菌的聚集和包涵体。
１４．Q： 当其他蛋白共染时，如何优化减少FITC 发射过滤装置的信号？
A： 染料的激发和发射光谱见操作手册P8。光谱显示会与FITC 有些重叠。FITC 可以与该染料一起使用，用488nm激发波长和515nm 发
射波长。如果FITC 有荧光的话就会起作用。否则，PROTEOSTAT® 染料会有溢出。建立设立一个不带有FITC 标记的抗体作为对照。
另外，可用Cy5 或者Coumarin 标记的抗体解决这个问题。
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| 产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 | 备注 |
| ENZ-51035-K100 | PROTEOSTAT® Aggresome detection kit PROTEOSTAT®蛋白聚集小体检测试剂盒 |
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| ENZ-51035-0025 | PROTEOSTAT® Aggresome detection kit PROTEOSTAT® 蛋白聚集小体检测试剂盒 |
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