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质谱级赖氨酰肽链内切酶
Lysyl Endopeptidase

质谱级赖氨酰肽链内切酶新品速递图wako.jpg

Lysyl Endopeptidase


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  本产品是质谱分析前处理时常用的蛋白分解酶即赖氨酰肽链内切酶,该酶可以特异性切除赖氨酸基团C末端的多肽,可用于蛋白测序分析和 Lys-X 化合物的酶合成。若同时使用赖氨酰肽链内切酶和胰酶,可更好地切断赖氨酸基团的多肽,增加多肽的数量。产品已按照使用习惯做成小包装,是方便使用的冷冻干燥品。20 μg/支可用于100-200个样品的凝胶内消化。


来源:细菌

外观:冻干粉(包含2 mmol/L Tris-HCl 缓冲液,pH8)

活性:0.03~0.07 AU/vial

分子量:27,000(琼脂糖过滤),30,000(SDS-PAGE)

溶解性:溶于水或缓冲液

稳定性:溶解于 pH 值 5.0-12.0 的 Tris 缓冲液中,可在4℃稳定保存2年;在 pH 值 6.0-11.0、30℃时能稳定保存,但温度超过50℃时不稳定。

最适pH值:9.0~9.5

等电点:6.9~7.0 

底物特异性:

可水解底物——Tos-Lys-OMe、Bz-Lys-NH2、Bz-Lys-pNA、Lys-pNA

不可水解底物——Bz-Arg-NH2、Bz-Arg-pNA、Arg-pNA

抑制剂:DFP、PMSF、TLCK



特点


●  高特异性、高蛋白质消化率、适用于蛋白质谱分析

  提高裂解效率、增加肽段数量

  根据使用量特意制备小包装,方便使用



应用


  分别采用胰蛋白酶(Tp、赖氨酰肽链内切酶(Lys-C)和 Tp与Lys-C 联用进行胶内酶切的效果比较。

  牛血清蛋白 BSA 的条带(100 ng)通过 SDS-PAGE 获得,然后分别用 Tp、Lys-C 和 Lys-C+Tp 进行酶切,再用 MALDI-TOFMS 法进行分析。

  这些蛋白酶的实验效果见下表。


表 1:Tp、Lys-C 和 Lys-C+Tp 的结果对照

这些结果表明 Lys-C 酶解的错误裂解率最低。Tp 酶解时加入 Lys-C 后,错误裂解率有所降低,同时,可以鉴定出更多的多肽。



Tp 

Lys-C

Lys-C+Tp

裂解位点

精氨酸和赖氨酸的C端 

赖氨酸的C端 

精氨酸和赖氨酸的C端

错误裂解率

(错误裂解所占比例  )

多(8%)

很少(0%)

少(3%)

鉴定出的多肽数量 

17

19

22


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胰蛋白酶(Tp)(图 a)和赖氨酰肽链内切酶(Lys-C)+Tp( 图 b)酶切后的质谱结果对照图。

Lys-C+Tp 酶切后,可以在 m/z=2000 时得到吸收峰,而单独的 Tp 酶切在 m/z=2000 时没有吸收峰。该结果表明 Lys-C 可以提高测序覆盖度。

 

( 数据由大阪医疗中心和妇婴健康研究所Y. Wada 博士提供 )



赖氨酰肽链内切酶


  赖氨酰肽链内切酶,最初由 Masaki 等人从土壤细菌中分离得到。该酶可以特异性剪切赖氨酸残基C末端和S-氨乙基半胱氨酸残基的肽键,用于蛋白测序和 Lys-X 化合物的酶催化合成。该酶稳定性高,在4M尿素或 0.1% SDS 溶液中 30℃ 孵育6小时之后,仍然拥有完整的生物活性。


外观

  冻干粉(包含ca. 10% Tris-HCl buffer,pH 8)

活性

  见包装

分子量

  27,000(凝胶过滤);30,000 (SDS-PAGE)

溶解性

  易溶于水或缓冲液

最佳pH

  9.0-9.5(酰胺酶的最佳活性 pH)

等电点

  6.9-7.0

抑制剂

  DFP、PMSF、TLCK

来源

  细菌

稳定性

 溶于pH 值 5.0-12.0 的缓冲液中,可于4℃稳定保存。溶于pH 值 6.0-11.0 的缓冲液中,可于30℃稳

 定保存,但是50℃及以上不稳定。

单位定义

 一单位酰胺酶(AU)指在30℃ pH 9.5 时每分钟产生1 μmol 对硝基苯胺所需的酶量。

底物特异性

 水解底物:Tos-Lys-Ome、Bz-Lys-NH2、Bz-Lys-pNA、Lys-pNA

 非水解底物:Bz-Arg-NH2、Bz-Arg-pNa、Arg-pNA


实验方法


1试剂:

A.0.2 mol/L AMP 缓冲液,pH值 9.5

      溶解 4.2 g 的2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇于 150 mL 的水中,加入1 mol/L HCl 调 pH 值至 9.5,再加水使体积至 200 mL。

B.2.5 mmol/L 底物溶液

      溶解 22.6 mg 的N-苯甲酰基-DL-精氨酰-4-硝基苯胺盐酸盐于 20 mL 水中。

C.   2 mmol/L Tris-HCl 缓冲液,pH8

      溶解 0.24 mg的2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇于 900 mL 水中,加入 0.1 mol/L HCl 调pH值至8,再加水使体积至1 L。

D.   酶溶液

      溶解1vial 的赖氨酰肽链内切酶于1mL 的溶剂C中,可直接加入。

E. 终止溶液

      将 55 mL 水和 45 mL 乙酸混合均匀。


 

2. 步骤


试剂

检测样品

空白对照

A

2.6 mL

2.6 mL

B

0.3 mL

0.3 mL


30℃ 预培养5分钟

D

0.1 mL

-

C

-

0.1 mL


立即混合均匀,30℃ 预培养25分钟

E

1.0 mL

1.0 mL

 

3. 单位的定义

酰胺酶单位是指 30℃、pH 9.5 时,每分钟产生1μmol 对硝基苯胺的酶量。

 

AU/vial = [(a-b) / 25] × (1/9.62) × (4.0/0.1)

a.    检测样品中的吸光度

b.    空白对照中的吸光度

 

胶内酶切的实验操作流程

  用聚硅酮处理的微量离心管和吸管端防止捕获任何蛋白。使用质谱分析用凝胶染色试剂盒,例如银染剂 MS 试剂盒(产品编号:299-58901)和负凝胶染色 MS 试剂盒(产品编号:293-57701

1.    电泳分离蛋白质样品;

2.    从凝胶中切割蛋白质片断并放入微量离心管;

3.    使凝胶脱色(可使用质谱分析用凝胶染色试剂盒中的脱色溶液);

4.    加入300 μL 乙腈到试管里,搅拌器振荡 30 分钟;

5.    去除乙腈,用 Parafilm 膜覆盖微量离心管。

6.    在 Parafilm 膜上打出针孔,真空干燥 15 分钟;

7.    100 μL 10 mmol/L DTT 溶解于 100 mmol/L 碳酸氢铵56℃恒温小时。

8.    室温冷却后,用等量的 50 mM 碘乙酰胺溶解于 100 mmol/L 碳酸氢铵暗处恒温 45 分钟并涡旋;

9.    用 100 μL 100 mmol/L 碳酸氢铵洗涤凝胶片段 10 分钟;

10.  用 300 μL 乙腈干燥凝胶片段 15 分钟;

11.  用 100 μL 100 mmol/L 碳酸氢铵溶胀凝胶片段 15 分钟;

12.  用 300 μL 乙腈再次干燥凝胶片段 15 分钟;

13.  去除液相,真空干燥凝胶片段 15 分钟;

14.  用 100 μL 赖氨酸内切酶溶液*在冰水浴中溶胀凝胶片段 45 分钟;

  *赖氨酸内切酶稀释于 50 mmol/L Tris-HCl  pH 8.5

15.  去除 100 μL 赖氨酸内切酶溶液,将凝胶片段放在 37、10 μL 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.5 中过夜;

16.  加入 50 μL 20mmol/L 碳酸氢铵 20 分钟内振荡凝胶片段次抽提多肽;

17.  加入 5% 甲酸/50% 乙腈 20 分钟内振荡凝胶片段次抽提多肽;

18.  如果需要用 Speed Vac. 浓缩多肽;

19.  用 ZipTip 脱盐和纯化多肽;

20.  如果需要用弱真空浓缩多肽至μL

21.  加入基质进行质谱分析。

 

注意:根据细菌的生理和形态特征分类,产品来源为水解无色杆菌,但是最近细菌分类学将这种细菌鉴定为产酶溶杆菌。


保存:暗处-20℃保存

 

规格:20 μg×5 vial



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产品编号产品名称包装应用
202-15951

Trypsin, from Porcine Pancreas

Mass Spectrometry Grade

猪胰腺胰蛋白酶质谱级别
5×20 μg蛋白质组学
056-05921Endoproteinase Asp-N, Sequencing grade
胞内蛋白酶 Asp-N(测序级别)
2 μg用于测序
050-05941Endoproteinase Glu-C, Sequencing grade
胞内蛋白酶 Glu-C(测序级别)
50 μg
164-13982V8 Protease [Endoproteinase Glu-C]
V8蛋白酶
2 mg生物化学



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0215252403092795.jpg

赖氨酰肽链内切酶,MS级

产品编号:125-05061

发表文献


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产品编号 产品名称 产品规格 产品等级
125-05061 Lysyl Endopeptidase, MS Grade 
赖氨酰肽链内切酶,MS级
20 μg×5 质谱级
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