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LiveReceptor AMPAR
内源性AMPA型谷氨酸受体(AMPAR)活细胞成像试剂

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LiveReceptor AMPAR




LiveReceptor AMPAR是一种可以在活细胞中对AMPA型谷氨酸受体(AMPA Receptor; AMPAR)进行特异性荧光标记的蛋白标记试剂。由于它能在活细胞中对内源性AMPAR进行标记,所以通过活细胞成像技术对生理性AMPAR进行行为分析的能力十分优秀。

 

※ 本产品是Funakoshi株式会社基于京都大学工学研究科 浜地教授的研究成果商品化而成。

※ 本产品仅供研究,研究以外不可使用。


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添加LiveReceptor AMPAR至初代培养海马神经细胞进行培养后,可用荧光素对内源性AMPAR进行标记。使用LiveReceptor AMPAR,可使活神经细胞中的AMPAR可视化。



◆关于受体活细胞成像方法的问题以及配体指向性蛋白标记


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■ 传统受体的成像方法及问题


配体指向性蛋白标记


为了克服过往的问题,京都大学工学研究科的浜地教授与清中准教授等人,确立了一项技术,利用蛋白表面反应基团酰基咪唑(acyl imidazole)仅对内源性目标受体蛋白进行荧光标记(图下半部分)。该方法只有在特异性配体与目标受体蛋白结合时,激活蛋白表面的反应基团酰基咪唑,可以选择性对目标受体蛋白进行荧光标记。由于接下来更换培养基可以去除多余配体和反应片段,因此可以观察到配体结合部位呈现空余状态的生理性受体蛋白行为。


参考文献:


1. Fujishima, et al., J. Am. Chem. Soc., 134, 3961~3964 (2012).

2. Miki, et al., Chem. Biol., 21, 1013~1022 (2014).

 


LiveReceptor AMPAR


LiveReceptor是以神经递质受体为目标的配体指向性蛋白标记试剂。LiveReceptor AMPAR是世界上第一种AMPA型谷氨酸受体(AMPAR)特异性荧光标记试剂1。它对阐明在记忆分子机制中发挥核心作用的AMPAR行为分析有用,并且作为脑神经基础研究为首的神经、精神疾病研究等治疗药物开发的优越试剂备受期待。


参考文献


1. Wakayama, et al., Nat. Commun., 8, 14850 (2017). [PMID : 28387242 ]Chemical labeling for visualizing native AMPA receptors in 

1. live neurons.

LiveReceptor AMPAR为文献中的CAM(FI)。

 


◆特点


● 可以在内源性AMPAR标记荧光素。

● AMPAR(Glu2-4亚单位)特异性高*,不会标记其他离子通道谷氨酸受体(NMDA行谷氨酸受体、海藻酸谷氨酸受体)。

● 添加培养基, 1~4小时的标记反应后,便可进行AMPAR实时成像。

● 由于没有膜渗透性,因此仅可标记细胞表面的AMPAR。

● 在过量表达培养神经细胞、培养大脑切片组织以及AMPAR(GluA2、GluA3A或者GluA4亚基)的细胞系上有应用案例。

● 由于是小分子,组织渗透性高,在脑组织急性切片上有可以标记至深部的应用案例。

● 经电生理学方法确认,标记后的AMPAR仍然保持离子通道功能。

● 推荐使用浓度1 μM,这个浓度下几乎没有细胞毒性。

● 由于使用荧光素用作荧光色素,所以有pH反应,并且内部化的标记AMPAR趋于淬灭。因此适于观察细胞表面的AMPAR。

● 以活细胞成像为首,可用于各种应用。详情请浏览下文应用实例

 

*由于不会标记GluA1亚基,所以不能使GluA1同聚物可视化。

 


◆应用


● 活细胞成像

● Western blot(抗荧光素抗体)

● 通过免疫沉淀(抗荧光素抗体)对AMPAR结合蛋白进行分析、研究

● 免疫染色(可以与抗其他因子的抗体进行共染色)

● 拮抗型抑制物质的探索以及活性评价

 


◆应用实例


神经细胞的活体成像


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添加1 μM LiveReceptor AMPAR及荧光标记配体(FL-ligand;阴性对照)至原代海马神经细胞中培养30 min,换液后进行实时成像。荧光标记配体无法观察神经细胞的形态;与之相反,使用LiveReceptor AMPAR可以观察到神经细胞的形态以及树突棘结构。



培养切片组织的实时成像


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海马的培养切片组织中,分别在含有和不含AMPAR特异性拮抗阻遏物NBQX(10 μM)的情况下,添加Live Receptor AMPAR(1 μM)。培养1小时,换液后进行实时成像。

不含NBQX(左):可观察到树突棘结构的荧光信号。

含有AMPAR特异性阻遏物NBQX(右):荧光信号消失。

结果显示,NBQX与 AMPAR配体的结合部位相互竞争,以及LiveReceptor AMPAR的荧光信号是AMPAR特异性的。



AMPAR特异性


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A:特异性验证


用LiveReceptor AMPAR导入荧光素后,裂解细胞,以抗荧光素抗体(anti-FL)进行Western blot进行检测,获得了相当于AMPAR的GluA2亚基的105 kDa的单条带。从该条带AMPAR特异性抑制物质NBQX消失来判断AMPAR特异性。

 


B:利用免疫沉淀证明其特异性


为鉴定通过LiveReceptor AMPAR 进行荧光素标记的蛋白,不使用抗荧光素抗体(anti-FL)进行免疫沉淀,而是使用对各谷氨酸受体亚基的特异性抗体进行Western blot。结果只发现AMPA型谷氨酸受体的亚基GluA2浓缩,其余GluN(NMDA型谷氨酸受体:NMDAR)和GluK(海藻酸型谷氨酸受体:KAR)并未发现免疫沉淀引起的浓缩。

 


C:利用免疫染色比较抗GluA抗体染色图像


利用LiveReceptor AMPAR在活细胞进行荧光素标记后,固定细胞,使用抗GluA2抗体进行免疫染色。可以发现,LiveReceptor AMPAR的染色图像和使用了抗GluA2抗体的染色图像基本一致。



观察组织深部


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将切片培养的小鼠大脑使用LiveReceptor AMPAR标记后,固定组织,以抗GluA2/3抗体进行免疫染色。x-y平面图像中,二者基本一致,但是从黄线部分的x-z断面可以发现,抗体组织渗透性低,只能染色切片表面。然而因为LiveReceptor AMPAR渗透到了组织深处,所以能够标记组织深层的AMPAR。(黑箭头:切片上端,白箭头:切片下端)。

 


通过FRAP分析行为分析AMPAR


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用LiveReceptor AMPAR标记神经细胞内源性AMPAR并通过FRAP(Fluorescence recovery after photobleaching)法分析细胞膜上的AMPAR运输速度。可观察到荧光迅速恢复的情况。

Recovery ratio:16%,diffusion coefficient:0.090 μm2s-1

 


利用药剂处理观察突触可塑性


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使用LiveReceptor AMPAR标记培养海马神经细胞后,用NMDA(50 μM)处理10 min并使用化学性LTD(Long-term depression;长时程抑制)诱导。在LTD诱导条件下,可观察到树突棘中标记AMPAR的数量明显减少。



拮抗抑制物质探索性筛选


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A:由于LiveReceptor AMPAR使用AMPAR特异性配体进行标记,因此可用于探索与AMPAR配体拮抗的抑制物质和拮抗

A:剂(competitive antagonist)。

A:可在细胞、组织中确认,LiveReceptor的标记显著收到AMPAR特异性抑制物质NBQX抑制。

B上部分:AMPAR大量表达细胞,B下部分:组织




产品列表
产品编号 产品名称 产品规格 产品等级 备注
FDV-0018A LiveReceptor AMPAR  10 μg - -

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