可实现局部组织结构可视化的荧光染料

HistoBright

HistoBright是一种可实现双光子激发的环境响应型膜染色荧光色素，组织渗透性优异，可根据组织的局部结构改变荧光特性，因此可实现高对比度的组织可视化。结合组织透明化处理和双光子激光显微镜使用，可对组织块进行深度观察和空间结构分析。

※ 本产品基于高知大学和爱媛大学的研究成果，由funakoshi（株）生产并销售。

※ 本产品仅供研究使用，研究以外的目的不可使用。

HistoBright 是一种环境响应型荧光染料，可根据溶剂的极性显示出大范围的波长。应用于透明化处理后的组织时，荧光会响应组织内的微环境而发生变化，随后配合双光子激光显微镜即可清晰地观察到组织结构。

◆传统的组织结构分析方法和新型的三维组织结构分析

传统的组织结构分析，是通过有色染料对组织进行染色实现的，如苏木精-伊红（HE）染色法。而使用这些有色染料很难将组织块整块染色，一般需制成薄切片后再进行观察。但薄切片很容易丢失组织结构的三维信息，因此需要制备大量切片才能重现三维结构。

HistoBright是高知大学教育研究部的仁子阳辅博士合成的新型环境响应型荧光染料（原著论文中的化合物名为PC），目前由爱媛大学医学部的今村健志博士、村上正基博士、川上良介博士推进开发应用于三维组织结构的荧光成像染料。HistoBright会聚集在生物膜上，并根据所在局部环境不同，荧光在绿光~近红外光的大范围内变化。因此，当HistoBright应用于生物组织时，它可以根据组织结构诱导荧光色调的变化，从而实现高对比度观察组织结构。由于HistoBright能够进行双光子激发，因此除了激光共聚焦显微镜外，还可以使用双光子激光显微镜进行观察。此外，配合组织透明化处理（除保持膜结构进行脱脂操作的方法外），使用HistoBright可在不破坏组织结构（不制备薄切片）的前提下观察厚组织样本，并通过双光子激光显微镜进行深度成像，实现组织的三维结构分析。

◆特点

● 环境响应型的膜染色试剂，能根据周围环境表现出绿光~近红外光的荧光特性。通过区分需要检测的荧光波长范围，可实现高对比度的局部组织结

　构可视化。

● 配合无脱脂处理的组织透明化处理（如RapiClear（SunJin Lab公司）、LUCID等），可实现深度的组织结构三维分析。

● ※ 使用表面活性剂（Triton X-100、Tween 20等）会溶解组织中的脂质膜，可能对HistoBright的染色产生影响，因此不推荐使用。如需使用，请讨论适用条件。

● 使用激光共聚焦显微镜镜（推荐激发光：488 nm激光）或双光子激光显微镜（推荐激发光：960 nm激光）皆可进行观察。

● 使用双光子激光显微镜观察时，可配合使用二次谐波发生（SHG）成像，在使用本试剂的同时观察未染色组织中的胶原纤维。

● 使用HistoBright进行染色和观察后，可进行HE染色。

◆原著原文

Inoue, K., et al., J. Mater. Chem. B., 10(10), 1641～1649 (2022). Synthesis and photophysical properties of a new push-pull pyrene dye with green-to-far-red emission and its application to human cellular and skin tissue imaging. [PMID：35194628]

◆原理

激发/发射光谱

HistoBright是一种根据溶剂的分子极性改变荧光特性的溶剂极性响应型荧光染料（Solvatochromic fluorescent dye）。根据溶剂的极性，荧光会从绿色（低极性）向近红外光（高极性）的范围内大幅变动。

脂质体膜模型中荧光光谱的变化

HistoBright对脂质膜显示高亲和性，并根据脂质膜的相态表现出不同的荧光特性。与有序相Lo模型（鞘磷脂（SM）/胆固醇（Chol））脂质体中的荧光最大值不同，无序相Ld模型（DOPC）脂质体中的最大波长也转移到了约30 nm的长波长范围，荧光量子产率也从0.72（SM/Chol）下降到了0.37（DOPC）。

※ 以上荧光光谱数据均由高知大学 仁子阳辅博士提供。

◆应用数据

使用双光子激光显微镜对透明化人正常皮肤组织进行成像

使用4% paraformaldehyde/ PBS固定人正常皮肤组织块后，制备成500 μm的切片，同时进行76 h的组织透明化处理（LUCID）和HistoBright（10 μM）染色。通过双光子激光显微镜，用960 nm处激光激发组织块，分别在492 nm（SHG：青色）、500-550 nm（绿色）、560~593nm（橙色）和 593-690 nm（红色）处分别获取荧光图像，制作以下4幅合成图像。

※ 492 nm（青色）来源于组织中胶原纤维的SHG信号，而非HistoBright来源的荧光信号。

接下来，使用双光子激光显微镜在Z轴方向以5 μm的间隔连续拍摄500 μm的图像，并使用图像分析软件进行三维构建，以三维方式将人皮肤组织的精细结构可视化。

使用双光子激光显微镜对透明化人正常皮肤组织进行三维成像

使用4% paraformaldehyde/PBS固定人正常皮肤组织块后，制备成1 mm的切片，同时进行72 h的组织透明化处理（RapiClear、SunJin Lab公司）＊、HistoBright（10 μM）染色和核染色（Hoechst33342）。通过双光子激光显微镜，用1100 nm处激光激发组织块，分别在＜492 nm（SHG：青色）、500~550 nm（绿色）、560~593 nm（橙色）和 593-690 nm（红色）处分别获取荧光图像，制作以下4幅合成图像。基于以上条件，在Z轴方向以5 μm的间隔连续拍摄，使用图像分析软件进行三维构建，将连续的数据制作成动画。

＊ 本实验中的组织块固定后未进行透膜处理，直接透明化处理和染色。

重复用于HE染色

使用HistoBright染色并观察人正常皮肤细胞组织块，在PBS中静置，去除透明化试剂。然后制备成薄切片，进行HE染色。已确认HistoBright染色后，仍可进行清晰的HE染色。

在激光共聚焦显微镜和双光子激光显微镜下观察染色

使用4% paraformaldehyde/ PBS固定人正常皮肤组织块后，制备成0.5 mm的切片，同时进行72 h的组织透明化处理（RapiClear、SunJin Lab公司）＊和HistoBright（10 μM）染色。随后，使用激光共聚焦显微镜镜（左图：激发光488 nm激光）和双光子激光显微镜（右图：激发光960 nm激光）进行观察。虽然两幅图像没有明显区别，但在双光子激光显微镜下可以观察到双光子激发特有的SHG信号（胶原纤维）。

＊ 本实验中的组织块固定后未进行透膜处理，直接透明化处理和染色。

※ 以上图像数据均由爱媛大学 川上良介博士提供。