可用于活细胞的不可逆GST抑制剂

CNBSF ＜Irreversible GST Inhibitor＞

CNBSF（2-chloro-5-nitrobenzensulfonyl fluoride）是针对谷胱甘肽 S-转移酶（GST）的不可逆性抑制剂。与目前已知的作为GST抑制剂广泛使用的利尿酸相比，抑制活性明显更高，且因其不可逆性，可长期保持GST失活。

※ 本产品基于名古屋大学 理科研究科 阿部洋教授的研究成果商品化而成。

添加CNBSF至HeLa细胞中不可逆地抑制细胞内的GST后，使用用于活细胞的GST活性检测探针DNs-Rh（#FDV-0030）观察残留的GST活性。可发现， CNBSF的添加显著地抑制了细胞内GST的酶活性。

◆GST以及抑制剂的含义

谷胱甘肽S-转移酶（GST）家族是广泛存在于细菌和动植物的酶家族，具有在细胞内将疏水性外源性物质（xenobiotics）结合到谷胱甘肽（GSH）中并转换为GSH共轭物（GSH-conjugate）的活性。MRP（multidrug resistance-associated protein）转运蛋白积极地将GSH共轭物释放到细胞外，有着去除杂质的功能。因此，GST作为解毒因子，将可能成为细胞毒素的外来化合物排出细胞而起作用。

另一方面，由于大多数抗癌药等药物也会通过GST转换为GSH共轭物排出细胞外，因此GST作为耐药因子，也呈现出了降低药效的负面影响。尤其是随着癌症的恶化，特定GST亚型（GSTP1）的表达水平增强，由此可推断出癌细胞获得了强耐药性。虽然可以期待通过抑制GST活性提高抗癌药在细胞内的滞留性，然而迄今使用的GST抑制物质并不完善。传统的GST抑制物质主要使用与GSH竞争抑制的竞争性抑制物质。然而，尽管这些竞争性抑制物质在体外实验中展现出色的抑制活性，但从细胞内的情况来看，GSH浓度约为数毫摩尔便算是极高浓度，在细胞内引发竞争、获得充分的抑制效果是十分困难的。

◆新型GST抑制策略 BSF抑制剂

名古屋大学的阿部洋教授等人使用benzensulfonyl fluoride（BSF）基作为新的GST抑制策略，致力于制造在细胞内的不可逆性抑制物质，并在最后成功开发出在活细胞内呈现出色抑制活性的CNBSF ^1）。CNBSF拥有细胞膜穿透性，进入细胞后与GST的杂质识别部位H-site结合。GSH与GST的G-site结合，CNBSF在GST的蛋白内部附着到GSH上转换为GSH共轭物（GS-5NBSF），而GS-5NBS立刻与GST的Tyr108（GSTP_1-1时）发生不可逆反应。这个反应使GS-BSF无法从GST上脱离，并且由于堵塞了H-site、G-site，使GST失活。与传统竞争性抑制物质相比，这个方法能够使GST不可逆性地失活，达到长期抑制的效果。

◆详细原理

■　抑制反应机构模型（以GSTP_1-1为例）

1.　CNBSF和GSH分别与GST的H-site、G-site结合，GST的酶活性依赖GSH的硫醇根阴离子与CNBSF反应。

1.　CNBSF的氯离子CI^-作为离去基团而脱离。

2.　在GST酶内生成GS-5NBSF。

3.　在GS-5NBSF的benzensulfonyl fluoride基中GSTP_1-1与Tyr108发生羟基反应。

4.　伴随着氟离子F⁻的脱离，GST与GS-5NBSF通过共价键交联。

◆特点

●　拥有膜穿透性，可用于活细胞

●　在细胞内通过GST附着于GSH，作为GST抑制物质发挥功能

●　因为是不可逆性抑制物质，可长期抑制。另外，不同于传统的可逆性化合物，在清洗后仍然保持抑制作用

●　与已知GST抑制物质ethacrynic acid（EA）相比，在活细胞实验中呈现高抑制活性

●　可与广泛的GST家族反应

●　经质谱确认本产品与内源性GST（GSTP1-1）共价结合

◆原著文献

1. Shishido, Y., et al., ChemBioChem. (in press),

1. "A covalent inhibitor for Glutathione S-Transferase Pi (GSTP1-1) in human cells."

◆应用实例

■　不可逆性GST抑制活性

使用GSTP_1-1重组体在体外实验评价抑制活性。GSTP_1-1在含有0.1 mM抑制物质的情况下于37°C反应2小时，在有和无超滤清洗后，使用1 μM的GST活性检测探针DNs-Rh（#FDV-0030）评价GST活性。从清洗后GST活性恢复可知，ethacrynic acid（EA）是可逆性抑制物质，从CNBSF清洗后仍保持抑制活性来看，CNBSF对GST的抑制是不可逆的。

■　活细胞中GST的抑制活性

用胰蛋白酶脱离NCI-H522细胞使其悬浮，然后添加1 mM的抑制物质在37°C下孵育15分钟。用PBS清洗细胞后，添加2.5 μM DNs-Rh（#FDV-0030），在37°C下反应1小时。然后再次使用PBS清洗细胞，去除未反应的试剂后，用流式细胞仪（Ex 490/Em 520 nm）定量。添加了CNBSF的细胞中，GST活性几乎完全消失，而且效果更甚于EA。

■　质谱鉴定GS-5NBSF结合位点

将化学合成的GS-5NBSF与纯化GSTP_1-1反应制备不可逆的加合物。质谱处理后，通过肽片段的MS / MS分析鉴定结合位点。结果显示，GS-5NBSF在Tyr108处结合。