EV-Perm™ 外泌体膜渗透处理用试剂盒

EV-Perm™ 外泌体膜渗透处理用试剂盒是一款可实现外泌体等细胞外囊泡（EV: Extracellular vesicle）内部蛋白检测的前处理试剂。至今研发的PS Capture™ 外泌体 ELISA 试剂盒系列和 PS Capture™ 外泌体流式试剂盒的检测对象仅限于外泌体表面标记物。但是，通过使用EV-Perm™处理外泌体样品，可提高外泌体的膜通透性，使抗体渗透到外泌体内部，从而检测存在于内部的标记蛋白。

※ 请配合PS Capture™ 外泌体 ELISA 试剂盒和 PS Capture™ 外泌体流式细胞术试剂盒使用本试剂。另外，检测抗体需单独制备。

◆特点

●　试剂盒的试剂（3种）可提高外泌体的膜渗透性

●　配合使用ELISA试剂盒和流式试剂盒，可检测外泌体内部的蛋白

●　除纯化外泌体外，还可用于细胞培养上清和体液样品

◆适用样品

●　纯化外泌体（细胞外囊泡）

●　细胞培养上清

●　体液（血清和血浆）样品

◆内部抗原检测原理

	①  捕获外泌体 ELISA板或磁珠固定化的Tim4蛋白 与外泌体表面的磷脂酰丝氨酸结合	② 提高膜渗透性 通过添加EV-Perm™， 提高外泌体的膜渗透性	③ 检测内部抗原 使抗体可渗透到外泌体内部， 并检测蛋白

◆应用实例

使用ELISA试剂盒检测内部标记物

使用EV-Perm™对外泌体样品进行渗透预处理，对从HEK293T细胞培养上清中纯化的外泌体内部的Alix，以及从H4细胞培养上清中纯化的外泌体内部的α-synuclein使用PS Capture™ 外泌体 ELISA 试剂盒（链霉亲和素HRP）进行检测。

【结果】通过渗透处理，使用ELISA试剂盒可检测外泌体内部的Alix、α-synuclein。

使用流式试剂盒检测内部标记物

使用EV-Perm™渗透处理，对从HEK293T细胞培养上清中纯化的外泌体内部的Alix、以及外泌体表面的CD63使用PS Capture™ 外泌体流式试剂盒进行检测。

【结果】通过渗透处理，使用流式试剂盒可检测外泌体内部的Alix。

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相关资料

想要使用ELISA Kit和EV-Perm™定量分析EV内部表达的标记蛋白A，有何建议的方法？

1. 准备能分泌含标记蛋白A的外泌体的细胞株（若没有，也可使用含有带标记蛋白A的外泌体的体液样品）

2. 从上述细胞株的培养上清（或体液样品）中纯化外泌体

2. ⇒通过Western blotting或外泌体提取液的ELISA检测确认标记蛋白A的存在

2. ⇒检测纯化外泌体的蛋白浓度或粒子数

3. 进行预实验（确认EV-Perm™ 处理、以及使用的生物素标记抗体是否有效）。

2. （1）制备上述纯化外泌体的系列稀释（一种通过一系列步骤稀释样品的方法），根据试剂盒的实验操作步骤，使用PS Capture™ ELISA试剂盒分

2. （1）别在有/无EV-Perm™ 处理的条件下，确认是否能检测出CD63与标记蛋白A的信号。

2. （2）在探讨（1）的同时，还需要讨论合适的生物素标记抗体的稀释倍数、链霉亲和素-HRP的稀释倍数（确认作为对照检测的CD63信号是否在

2. （1）有/无EV-Perm™ 处理的条件下均能被检测。此外，与未经EV-Perm™ 处理的样品相比，经EV-Perm™ 处理检测到的CD63信号略低。并

2. （1）且，适用于检测标记蛋白A和检测CD63的生物素标记抗体的稀释倍数、链霉亲和素-HRP的稀释倍数可能有所差异。）

上述讨论中，在经EV-Perm™ 处理的条件下如检测到标记蛋白A的信号，建议在经EV-Perm™ 处理的ELISA检测的450 nm吸光度值（减去620 nm亚波长吸光度值后的值）的0.1~0.2之间讨论纯化外泌体的稀释倍数，并确定制备标准曲线用纯化外泌体的系列稀释。

4. 进行本实验。

4. 制备标准曲线（此步骤需使用进行EV-Perm™ 处理）

2. （1）制备标准品（纯化外泌体）的标记蛋白A信号落在ELISA检测的450 nm吸光度（减去620 nm亚波长吸光度后的值）的0.1~0.2之间的系列

2. （1）稀释。 稀释使用试剂盒配套的Reaction Buffer。

2. （2）制备在已设定的标准曲线吸光度范围内的样品稀释液（建议在预实验时讨论、确定合适的稀释倍数）

2. 检测、计算样品浓度（此步骤需要使用ELISA试剂盒进行处理）

2. （1）对N=2时的标准品的系列稀释液和样品稀释液进行检测。　

2. （2）根据标记蛋白A的检测吸光度制备标准曲线，计算各样品的浓度（标准品的相对浓度）。

2. （3）比较各样品的标记蛋白A的浓度。